不同神經(jīng)移植體移植修復(fù)自體周圍神經(jīng)缺損時的再生效果比較＊!

黃啟順， 甘 萌， 鄭懷遠， 周學武， 周 攀， 陳振兵

華中科技大學同濟醫(yī)學院附屬協(xié)和醫(yī)院手外科，武漢 430022

目前，對于周圍神經(jīng)損傷后缺損的修復(fù)，除了改變神經(jīng)走行方向、屈曲其所跨過的關(guān)節(jié)以彌補較短的神經(jīng)缺損外，大部分還需要用移植的辦法進行解決。神經(jīng)移植方法甚多，有自體、異體、異種神經(jīng)移植，非神經(jīng)組織移植和人工神經(jīng)移植等［1－2］。在這些方法之中，無張力的自體神經(jīng)移植仍然是神經(jīng)缺損修復(fù)最主要的方法，其余的都存在著或多或少的、這樣或那樣的問題。周圍神經(jīng)缺損是一種混合神經(jīng)缺損，采

用自體神經(jīng)移植修復(fù)時常用腓腸神經(jīng)或橈神經(jīng)淺支，而這二者均為感覺神經(jīng)，在結(jié)構(gòu)及超微結(jié)構(gòu)上與運動神經(jīng)纖維有所區(qū)別。臨床中也發(fā)現(xiàn)，用廢棄的混合神經(jīng)移植修復(fù)神經(jīng)缺損，術(shù)后神經(jīng)恢復(fù)效果比用單純感覺神經(jīng)移植修復(fù)的效果好，其中神經(jīng)移植體結(jié)構(gòu)可能是影響再生效果的一個重要方面。為此，我們建立了大鼠坐骨神經(jīng)缺損模型，并采用自體不同類型神經(jīng)移植體修復(fù)，以研究不同類型神經(jīng)移植體的結(jié)構(gòu)差異對混合神經(jīng)缺損修復(fù)后再生效果的影響。

1 材料與方法

1.1 動物模型及分組

清潔級3周齡SD大鼠45只（華中科技大學同濟醫(yī)學院實驗動物學部提供，編號：13314），隨機分為3組，每組15只。將右側(cè)坐骨神經(jīng)自梨狀肌下緣0.5cm處切斷，并將遠端切除0.5cm，制成神經(jīng)缺損模型。運動神經(jīng)移植組：取左側(cè)后肢的股神經(jīng)運動支約1.5cm長，重疊3股，移植修復(fù)；感覺神經(jīng)移植組：取左側(cè)后肢的腓腸神經(jīng)橋接1.5cm，重疊3股，移植修復(fù)；混合神經(jīng)移植組：取左側(cè)后肢同部位坐骨神經(jīng)0.5cm移植修復(fù)。見圖1。術(shù)后動物分籠飼養(yǎng)。

1.2 神經(jīng)再生長度檢測

于術(shù)后2、4、8周分別從各組中隨機抽取5只動物，1%戊巴比妥（50mg／kg）腹腔內(nèi)注射麻醉，暴露出右側(cè)坐骨神經(jīng)移植修復(fù)段，觀察神經(jīng)大體生長情況。用顯微外科鑷以1mm的間隔由遠而近夾捏神經(jīng)，標記出最早出現(xiàn)腓腸肌收縮反應(yīng)的部位，測量此點與近端吻合口之間的距離，此即運動神經(jīng)最大的再生長度，以此作為神經(jīng)再生速度的觀察指標［3］。

圖1 坐骨神經(jīng)缺損的神經(jīng)移植修復(fù)手術(shù)Fig.1 Nerve transplantation for the repair of sciatic nerve defect

1.3 肌肉濕重檢測

于術(shù)后2、4、8周將各組進行神經(jīng)再生長度檢測后的動物處死，將腓腸肌自股骨內(nèi)外髁起點至跟骨結(jié)節(jié)止點完整取下，用測量儀準確稱取肌肉濕重。

1.4 組織形態(tài)學測定

術(shù)后第8周，神經(jīng)再生長度測定后將動物處死，取脛神經(jīng)遠側(cè)吻合口遠端3mm神經(jīng)組織，將取得的神經(jīng)樣本用2.5% 戊二醛溶液前固定，餓酸固定液后固定，梯度濃度乙醇脫水，環(huán)氧樹脂618包埋，切片厚度為1μm，甲苯胺藍染色，在光學顯微鏡下觀察再生神經(jīng)纖維總數(shù)和華勒氏變性的程度。制備超薄切片，枸櫞酸鉛及醋酸雙氧鈾染色，電鏡下測量神經(jīng)纖維的直徑及髓鞘的厚度。

所有鏡下組織圖像采用形態(tài)測定軟件（Leco Inst-ruments，St.Joseph，MI）進行分 析。在 放 大1 000倍鏡下，每根神經(jīng)隨機選擇4個區(qū)域進行分析，鏡下計數(shù)神經(jīng)纖維的數(shù)目并測出神經(jīng)束的橫截面積，神經(jīng)纖維的總數(shù)／神經(jīng)束面積即為神經(jīng)纖維密度（根／單位面積）。

1.5 統(tǒng)計學分析

實驗所得數(shù)據(jù)用均數(shù)±標準差（±s）表示，采用SPSS 12.0統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進行分析，組間計量資料比較采用t檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 神經(jīng)再生長度

術(shù)后2周，各實驗組神經(jīng)再生長度差異無統(tǒng)計學意義。術(shù)后4、8周，運動神經(jīng)移植組及混合神經(jīng)移植組神經(jīng)再生長度差異無統(tǒng)計學意義，但均大于感覺神經(jīng)移植組，差異均有統(tǒng)計學意義（均P＜0.05），見表1。

2.2 肌肉濕重

術(shù)后2、4周時3組間腓腸肌濕重差異無統(tǒng)計學意義。術(shù)后8周時，運動神經(jīng)移植組及混合神經(jīng)移植組間腓腸肌濕重差異無統(tǒng)計學意義，但均大于感覺神經(jīng)移植組，差異有統(tǒng)計學意義（均P＜0.05），見表2。與同時間點感覺神經(jīng)移植組比較，＊P＜0.05

表1 各組神經(jīng)再生長度比較（mm，±s，n＝5）Table 1 Comparison of the length of the regenerated nerve among the three groups（mm，±s，n＝5）

表1 各組神經(jīng)再生長度比較（mm，±s，n＝5）Table 1 Comparison of the length of the regenerated nerve among the three groups（mm，±s，n＝5）

組別 術(shù)后時間2周 4周 8周感覺神經(jīng)移植組4.0±0.4 9.1±2.2 15.8±1.2運動神經(jīng)移植組 4.5±0.4 10.5±1.8＊ 19.1±1.4＊混合神經(jīng)移植組 4.3±0.2 10.4±2.1＊ 20.6±1.5＊

表2 各組腓腸肌濕重的比較（g，±s，n＝5）Table 2 Comparison of the wet weight of the gastrocnemius muscle among the three groups（g，±s，n＝5）

表2 各組腓腸肌濕重的比較（g，±s，n＝5）Table 2 Comparison of the wet weight of the gastrocnemius muscle among the three groups（g，±s，n＝5）

與同時間點感覺神經(jīng)移植組比較，＊P＜0.05

組別 術(shù)后時間2周 4周 8周感覺神經(jīng)移植組2.63±0.21 2.12±0.17 1.32±0.14運動神經(jīng)移植組 2.71±0.18 2.47±0.16 1.92±0.13＊混合神經(jīng)移植組 2.69±0.17 2.51±0.15 2.03±0.11＊

2.3 再生神經(jīng)纖維形態(tài)學觀察

術(shù)后8周，染色后光鏡下運動神經(jīng)移植組和混合神經(jīng)移植組可見大量成熟的再生神經(jīng)纖維，束膜結(jié)構(gòu)清晰，軸突排列整齊、規(guī)則；感覺神經(jīng)組只能見到少量再生神經(jīng)纖維，未形成束膜結(jié)構(gòu)，軸突走行仍不規(guī)則（圖2）。

在電子顯微鏡下，運動神經(jīng)移植組和混合神經(jīng)移植組可以見到大量的神經(jīng)纖維再生以及成熟的神經(jīng)纖維和髓鞘形成，并可以見到在華勒氏變性過程中清除神經(jīng)碎片的巨噬細胞。感覺神經(jīng)移植組可以同時見到有髓鞘和無髓鞘的神經(jīng)纖維再生，但是神經(jīng)纖維的數(shù)目和髓鞘的厚度則要小很多（圖3）。

2.4 各組神經(jīng)再生效果的比較

術(shù)后8周時，運動神經(jīng)移植組與混合神經(jīng)移植組的再生神經(jīng)纖維總數(shù)、神經(jīng)纖維的密度差異無統(tǒng)計學意義，但均大于感覺神經(jīng)移植組，差異均有統(tǒng)計學意義（均P＜0.05），見表3。

圖2 光鏡下觀察術(shù)后8周再生神經(jīng)軸突（甲苯胺藍染色，×400）Fig.2 The axon of the regenerated nerve under the light microscope at 8weeks post operation（toluidine blue staining，×400）

圖3 電鏡下觀察術(shù)后8周再生神經(jīng)髓鞘（×1 000）Fig.3 The myelin of the regenerated nerve under the electron microscope at 8weeks post operation（×1 000）

表3 各組術(shù)后8周神經(jīng)纖維總數(shù)以及密度的比較（±s，n＝5）Table 3 Comparison of the total number and the density of the nerve fibers among different groups at 8weeks post operation（±s，n＝5）

表3 各組術(shù)后8周神經(jīng)纖維總數(shù)以及密度的比較（±s，n＝5）Table 3 Comparison of the total number and the density of the nerve fibers among different groups at 8weeks post operation（±s，n＝5）

與感覺神經(jīng)移植組比較，＊P＜0.05

組別 神經(jīng)纖維總數(shù)（根）神經(jīng)纖維密度（根／mm2）感覺神經(jīng)移植組416.2±32.3 753.8±62.5運動神經(jīng)移植組 1 183.5±67.3＊ 2 346.6±213.2＊混合神經(jīng)移植組 1 082.2±64.4＊ 2 171.7±789.3＊

3 討論

在人體正常的結(jié)構(gòu)中，支配肌肉的運動神經(jīng)纖維主要為α神經(jīng)纖維，其直徑約為17μm，而皮膚感覺神經(jīng)纖維為α2類感覺神經(jīng)纖維，它的直徑約為5～15μm。混合神經(jīng)再生過程中，其中的運動神經(jīng)纖維和感覺神經(jīng)需要選擇合適的管道通過，當用相同神經(jīng)纖維管徑的運動神經(jīng)橋接時，再生運動神經(jīng)纖維能獲得更合適的延伸空間；當用感覺神經(jīng)橋接時，其纖維管道則明顯小了很多了，再生的運動神經(jīng)纖維需要強行通過這一瓶頸。從兩者的微觀物理結(jié)構(gòu)來看，運動神經(jīng)移植物與混合神經(jīng)中的運動神經(jīng)纖維管徑更匹配。Robinson等［4］采用大鼠股神經(jīng)Y管模型研究運動軸突趨化性再生的準確度，結(jié)果發(fā)現(xiàn)遠端插入大小相似的運動和感覺神經(jīng)時，再生的運動軸突早期均等地向兩側(cè)生長，但最終趨向于運動神經(jīng)端；遠端插入的感覺神經(jīng)端較粗大時，再生的運動軸突則明顯趨向于感覺神經(jīng)端生長。這在本實驗中也得到了體現(xiàn)。在光學顯微鏡下，運動神經(jīng)移植組與混合神經(jīng)移植組在神經(jīng)纖維的總數(shù)、神經(jīng)的密度上都明顯優(yōu)于感覺神經(jīng)移植組。而且到術(shù)后第8周，在防止肌萎縮及恢復(fù)所支配肌肉功能方面，運動神經(jīng)移植組和混合神經(jīng)移植組也優(yōu)于感覺神經(jīng)移植組。形態(tài)學方面，感覺神經(jīng)移植組鏡下見到更多的是雜亂的細胞殘片。在電子纖維鏡下進一步觀察，運動神經(jīng)移植組可見到成熟粗壯的再生神經(jīng)纖維，再生神經(jīng)纖維直徑以及髓鞘的厚度上要優(yōu)于感覺神經(jīng)移植組。這一系列的組織形態(tài)學測定表明，運動神經(jīng)或混合神經(jīng)移植組的物理微觀結(jié)構(gòu)更有利再生神經(jīng)纖維的生長。

神經(jīng)再生有趨化性在學術(shù)界得到了廣泛的承認，其理論的基本觀點為：神經(jīng)在再生的過程中，新生的軸突受到遠端神經(jīng)或靶組織所釋放的化學物質(zhì)的誘導(dǎo)作用而定向生長。神經(jīng)受損后神經(jīng)遠端在2～3d內(nèi)會發(fā)生華勒氏變性，包括軸突及其髓鞘的清除和施萬細胞的增殖。這些未分化的施萬細胞在基底膜管內(nèi)形成Blanger帶，并產(chǎn)生多種神經(jīng)趨化因子和營養(yǎng)因子，而這些因子能夠引導(dǎo)及促進神經(jīng)的再生。然而，施萬細胞分泌的趨化及神經(jīng)營養(yǎng)因子在感覺及運動神經(jīng)的表達和分布有所不同。如L2／HNK-1主要由運動神經(jīng)中的施萬細胞分泌，在培養(yǎng)液中加入L2／HNK-1發(fā)現(xiàn)，其只影響運動神經(jīng)元生長，而不影響感覺神經(jīng)元［3，5］。當運動神經(jīng)作為橋接物時，其含有的施萬細胞所產(chǎn)生的L2／HNK-1能誘導(dǎo)再生神經(jīng)纖維沿著基底膜支架向遠端生長。而感覺神經(jīng)移植物的施萬細胞不能分泌L2／HNK-1，因而不具備這種誘導(dǎo)作用。并且Brenner等［5］的實驗顯示，感覺神經(jīng)抑制物對神經(jīng)的再生似乎還有抑制作用。實驗中，用隱神經(jīng)作為移植物橋接脛神經(jīng)觀察神經(jīng)再生，當增加隱神經(jīng)的股數(shù)時，再生的神經(jīng)纖維總數(shù)、神經(jīng)纖維的密度并沒有隨著增加，反而出現(xiàn)了相應(yīng)的減少，而運動神經(jīng)組則沒有這種現(xiàn)象出現(xiàn)。作為移植物的感覺神經(jīng)是否產(chǎn)生了某種物質(zhì)或者有某種機制阻礙了神經(jīng)纖維的再生，尚有待于進一步研究。

本研究顯示，不同的神經(jīng)移植材料對自體神經(jīng)移植再生效果有著顯著影響，且運動神經(jīng)及混合神經(jīng)移植修復(fù)自體周圍神經(jīng)缺損時的再生效果優(yōu)于感覺神經(jīng)移植，其原因與移植神經(jīng)的微觀物理結(jié)構(gòu)和神經(jīng)再生的趨化性有關(guān)。

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