1，8-桉葉油素對(duì)小鼠的經(jīng)口急性毒性和蓄積毒性的研究

杜永華，王 川，周黎軍，張 萍，魏 琴，*，殷中瓊，蔣勤久，蔣吉洪

(1.宜賓學(xué)院西南特色經(jīng)濟(jì)植物保護(hù)與利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川宜賓644000;2.宜賓學(xué)院食品科學(xué)與工程研究所，四川宜賓644000;3.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，四川雅安625014;4.宜賓縣生產(chǎn)力促進(jìn)中心，四川宜賓644000)

1，8－桉葉油素(1，8－cineole，C10H18O)為無(wú)色透明油狀液體，具有樟腦氣息和辛辣涼味，主要存在于桉樹(shù)和油樟等芳香植物的揮發(fā)油中，是我國(guó)食品添加劑－桉葉油的主要成分(GB10351－2008)。研究表明，1，8－桉葉油素具有抗氧化［1］、抗菌［2］、殺蟲(chóng)［3］、鎮(zhèn)痛抗炎［4－5］和促進(jìn)透皮吸收滲［6］等作用，已廣泛用于香料、食品、醫(yī)藥、化工和國(guó)防等領(lǐng)域。Santos研究了［7］1，8－桉葉油素對(duì)大鼠經(jīng)口急性毒性，其 LD50為(2.85 ± 0.33)g/kg。余永莉等［6，8－9］研究發(fā)現(xiàn)桉樹(shù)葉揮發(fā)油對(duì)小鼠的經(jīng)口LD50為1824.01mg/kg，屬低毒物品，無(wú)明顯遺傳毒性，無(wú)胚胎毒性和致畸作用。張笑樂(lè)等［10］研究發(fā)現(xiàn)油樟葉揮發(fā)油對(duì)家兔皮膚無(wú)光毒性，對(duì)完整皮膚無(wú)刺激性，中等劑量對(duì)破損皮膚有可逆性刺激性，對(duì)眼睛有一定刺激性。而對(duì)油樟葉揮發(fā)油中1，8－桉葉油素的毒性研究未見(jiàn)報(bào)道。本文研究了1，8－桉葉油素對(duì)小鼠的經(jīng)口急性毒性和蓄積毒性，為其安全性評(píng)價(jià)提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1，8－桉葉油素 由油樟葉揮發(fā)油中分離，純度大于 99.5%，購(gòu)自宜賓市江南香料廠(chǎng)，批號(hào)20101205;吐溫－80 分析純，成都市科龍化工試劑廠(chǎng)。

清潔級(jí)昆明小鼠 體重為18～22g，購(gòu)于成都達(dá)碩實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所，合格證號(hào):SCXK(川)2008－24。小鼠專(zhuān)用生長(zhǎng)維持飼料，常規(guī)方式飼養(yǎng)，自然采光，自由采食飲水。

AL204電子天平 梅特勒－托利多儀器有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 1，8－桉葉油素對(duì)小鼠的經(jīng)口急性毒性實(shí)驗(yàn)將1，8－桉葉油素用2%吐溫－80配制成分散體系，用蒸餾水稀釋成不同濃度的溶液，以2%吐溫－80為溶劑對(duì)照，按小鼠體重灌胃。預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明小鼠經(jīng)口灌胃1，8－桉葉油素0%和100%死亡劑量估計(jì)值分別為3000mg/kg和5000mg/kg。正式實(shí)驗(yàn)取60只小鼠隨機(jī)分為6組，每組10只，雌雄各半，灌胃前禁食16h，不禁水。1～5組為染毒劑量組，組間劑量比為 1.14，一次性灌胃分別為 2960.39、3374.85、3847.33、4385.96、5000mg/kg·bw，第 6 組為溶劑對(duì)照組。灌胃染毒后連續(xù)觀(guān)察14d，記錄小鼠精神、攝食、飲水、呼吸、活動(dòng)、死亡及病理學(xué)變化情況，采用改良寇氏法計(jì)算LD［11］50。

1.2.2 1，8－桉葉油素對(duì)小鼠的蓄積毒性實(shí)驗(yàn) 取40只小鼠隨機(jī)分為2組，每組20只，雌雄各半，采用固定劑量法染毒，實(shí)驗(yàn)組小鼠每天經(jīng)口染毒1/5LD50(769.47mg/kg)劑量的1，8－桉葉油素，連續(xù)灌胃染毒28d，對(duì)照組小鼠給予同劑量的溶劑。實(shí)驗(yàn)期內(nèi)小鼠累計(jì)死亡數(shù)達(dá)50%，終止實(shí)驗(yàn)。按K=LD50(n)/LD50(1)計(jì)算累積系數(shù)(K)，以評(píng)價(jià)化合物對(duì)機(jī)體蓄積性毒性的大小，是判斷化合物是否引起潛在慢性中毒的依據(jù)之一，其中LD50(n)為固定劑量多次染毒引起半數(shù)小鼠死亡的總累積劑量，LD50(1)為一次染毒引起半數(shù)小鼠死亡的劑量。實(shí)驗(yàn)期間觀(guān)察記錄小鼠的精神、食欲、飲水及死亡情況，實(shí)驗(yàn)結(jié)束剖殺各組小鼠，觀(guān)察組織病理變化，計(jì)算飼料利用率(每食入100g飼料所增長(zhǎng)的體重克數(shù))和臟器指數(shù)(某臟器與單位體重之比值)［12］。

1.2.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)處理 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS17.0分析軟件進(jìn)行組間顯著性分析，數(shù)據(jù)以ˉX±S表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 急性毒性實(shí)驗(yàn)

小鼠染毒后活動(dòng)減少，嚴(yán)重者出現(xiàn)呼吸急促或呼吸困難、精神萎靡、俯臥、拱背、不食等癥狀，1h～4d內(nèi)先后死亡;輕者出現(xiàn)反應(yīng)遲鈍、精神不振、食欲減弱等癥狀，4d后不再死亡，逐步恢復(fù)正常。對(duì)照組小鼠精神、攝食、飲水、呼吸及活動(dòng)未見(jiàn)異常，無(wú)死亡現(xiàn)象。剖檢死亡小鼠可見(jiàn)小鼠胃和小腸輕度脹氣，輕度充血，肝腎有少量出血點(diǎn)，其余組織器官未見(jiàn)明顯異常變化。小鼠死亡情況見(jiàn)表1，采用改良寇氏法計(jì)算1，8－桉葉油素對(duì)小鼠的經(jīng)口 LD50為3847.33mg/kg，LD5095%置信區(qū)間為3352.80～4414.82mg/kg。與Santos報(bào)道［7］的 1，8－桉葉油素對(duì)大鼠經(jīng)口 LD50(2.85±0.33)g/kg相比，本實(shí)驗(yàn)測(cè)得的小鼠經(jīng)口LD50較高，按化學(xué)品毒理學(xué)分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)均為低毒化學(xué)品。1，8－桉葉油素對(duì)哺乳動(dòng)物的急性毒性可能與動(dòng)物種屬有關(guān)。Vincenzi等［13］報(bào)道大鼠對(duì)桉葉油素的敏感性比小鼠高，大鼠在600mg/kg劑量經(jīng)口染毒時(shí)出現(xiàn)毒性反應(yīng)，小鼠在1200mg/kg劑量下仍未觀(guān)察到毒性反應(yīng)。刷尾負(fù)鼠能耐受每天食用含3.6g/kg 1，8－桉葉油素的飼料［14］。人在誤食桉葉油后可出現(xiàn)急性中毒反應(yīng)，主要表現(xiàn)為心跳加速、呼吸急促、惡心、嘔吐、無(wú)力、嗜睡，甚至昏迷等癥狀，也有小孩誤食3.5～5mL桉葉油引起死亡的報(bào)道［13］。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，1，8－桉葉油素急性中毒時(shí)可引起小鼠肝腎輕度損傷，與Vincenzi等報(bào)道1，8－桉葉油素可引起大鼠肝腎損傷［13］一致。Kristiansen 和 Madsen 報(bào)道［15］高劑量1，8－桉葉油素能誘發(fā)大鼠近端腎小球上皮細(xì)胞微球蛋白升高。研究發(fā)現(xiàn)桉葉油可引起大鼠血液循環(huán)加快、血管擴(kuò)張和血壓降低等反應(yīng)［16］，減少大鼠心肌內(nèi)膜鈣離子的流入而降低心肌收縮能力［17］，1，8－桉葉油素急性毒作用機(jī)理是否與其相關(guān)還有待進(jìn)一步研究。

表1 1，8－桉葉油素對(duì)小鼠經(jīng)口急性毒性實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 1 The result of oral acute toxicity test of 1，8－cineole on mice

2.2 蓄積毒性實(shí)驗(yàn)

2.2.1 臨床觀(guān)察 實(shí)驗(yàn)期間全部小鼠食欲、行動(dòng)、被毛光潔度與色澤、呼吸，神態(tài)等均正常，實(shí)驗(yàn)組小鼠未見(jiàn)明顯的中毒癥狀。經(jīng)口染毒28d后，對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組的20只小鼠均全部存活，其蓄積毒性系數(shù)K＞5，剖殺后各組小鼠均未見(jiàn)明顯異常病理變化。根據(jù)蓄積系數(shù)分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)［12］，本次實(shí)驗(yàn)未觀(guān)察到1，8－桉葉油素對(duì)實(shí)驗(yàn)小鼠有蓄積性毒性。余永莉等［6－7］的實(shí)驗(yàn)表明桉葉油對(duì)小鼠無(wú)明顯的遺傳毒性。美國(guó)食品香料和萃取物制造者協(xié)會(huì)(FEMA)規(guī)定1，8－桉葉油素在食品中最高參考用量為:軟飲0.13mg/kg，冷飲0.05mg/kg，糖果 15mg/kg，焙烤食品 0.5～4.0mg/kg，口香糖190mg/kg。本實(shí)驗(yàn)所選蓄積性毒性實(shí)驗(yàn)劑量遠(yuǎn)高于FEMA規(guī)定劑量，可見(jiàn)如果按規(guī)定的劑量和方法使用，1，8－桉葉油素是比較安全的。1，8－桉葉油素的蓄積毒性不明顯，可能與其經(jīng)口生物利用度較低、生物代謝較快有關(guān)。Mclean等［18］報(bào)道刷尾負(fù)鼠飼喂低劑量的1，8－桉葉油素其口服生物利用度F僅為為0.05，半衰期T1/2為70min，腸管循環(huán)和肝微粒體代謝是導(dǎo)致口服生物利用度低的重要因素。研究發(fā)現(xiàn)1，8－桉葉油素能增加谷胱甘肽(GSH)、過(guò)氧化氫酶(CAT)、谷胱甘肽過(guò)氧化酶(GSH－Px)、銅鋅趨氧化物歧化酶(CuZn－SOD)的活性，抑制脂肪氧化酶活性，表現(xiàn)出較強(qiáng)抗氧化作用，能保護(hù)乙醇誘導(dǎo)的大鼠胃損傷［19］，保護(hù)氨基半乳糖/脂多糖［20］和 2，3，7，8－四氯二苯并二噁英［21］誘導(dǎo)的肝損傷。1，8－桉葉油素的抗氧化作用是否與其無(wú)明顯蓄積毒性相關(guān)還需進(jìn)一步研究。

表2 蓄積毒性實(shí)驗(yàn)中1，8－桉葉油素對(duì)小鼠飼料利用率的影響(±S)Table 2The feed conversion rate of mice in each group(士S)

表2 蓄積毒性實(shí)驗(yàn)中1，8－桉葉油素對(duì)小鼠飼料利用率的影響(±S)Table 2The feed conversion rate of mice in each group(士S)

注:＊＊表示與對(duì)照組相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)的差異(p＜0.01)。

組別飼料利用率(g/100g)第1周 第2周 第3周 第4周對(duì)照組 15.68±0.280 8.88±0.271 4.49±0.102 4.17±0.188實(shí)驗(yàn)組 15.04±0.245 6.84±0.285＊＊3.72±0.171 2.95±0.160

2.2.2 飼料利用率 1，8－桉葉油素對(duì)小鼠的飼料利用率的影響結(jié)果見(jiàn)表2。由表2可知，與對(duì)照組相比，1，8－桉葉油素組小鼠的飼料利用率有不同程度的降低，第二周時(shí)染毒組小鼠的飼料利用率與對(duì)照組的差異存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.01)，其余時(shí)間段染毒組與對(duì)照組無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p＞0.05)，表明小鼠對(duì)1，8－桉葉油素具有一定階段性耐受適應(yīng)能力，小鼠的飼料利用率受1，8－桉葉油素的影響不大。研究發(fā)現(xiàn)刷尾負(fù)鼠能根據(jù)體內(nèi)血中1，8－桉葉油素水平調(diào)節(jié)采食量，當(dāng)刷尾負(fù)鼠血中1，8－桉葉油素濃度增加到一定水平后其采食量會(huì)下降，達(dá)到一定程度耐受后，其總體食物消耗量可逐步恢復(fù)正常，在1，8－桉葉油素?cái)z入量增加過(guò)程中，由于肝酶的活性引起桉葉油素代謝加快和生物利用度下降，使其血中1，8－桉葉油素濃度并未增加［22］。Boyle和 McLean報(bào)道刷尾負(fù)鼠對(duì)1，8－桉葉油素的最大日攝入量可達(dá)(3.8±0.2)g/kg［23］。小鼠飼料利用率的變化是否與其血中1，8－桉葉油素水平有關(guān)需進(jìn)一步研究。

2.2.3 臟器系數(shù) 1，8－桉葉油素對(duì)小鼠臟器系數(shù)的影響結(jié)果見(jiàn)表3，由表3可知，小鼠染毒28d后，實(shí)驗(yàn)組小鼠心、肝、脾、肺、腎、腦、生殖腺的臟器系數(shù)與對(duì)照組相比均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p＞0.05)。表明小鼠按1/5 LD50劑量連續(xù)染毒28d，1，8－桉葉油素對(duì)小鼠的臟器無(wú)明顯不良影響(p＞0.05)。小鼠飼料利用率與臟器系數(shù)的測(cè)定結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)了1，8－桉葉油素對(duì)小鼠無(wú)明顯蓄積毒性的臨床觀(guān)察結(jié)果。

表31 ，8－桉葉油素對(duì)小鼠臟器系數(shù)的影響(ˉX±S)Table 3 Effect of 1，8－cineole on organ coefficient in mice(ˉX±S)

3 結(jié)論

急性毒性實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，1，8－桉葉油素對(duì)小鼠經(jīng)口LD50為3847.33mg/kg.bw，屬低毒化學(xué)品，小鼠急性毒性主要靶器官為肝臟和腎臟。將其作為食品添加劑時(shí)需嚴(yán)格控制其用量，避免人中毒事件。

蓄積性毒性實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，1，8－桉葉油素對(duì)小鼠經(jīng)口蓄積毒性系數(shù)K＞5，未觀(guān)察到蓄積性毒性，對(duì)小鼠飼料利用率影響不大，對(duì)臟器官無(wú)明顯不良影響，在食品中按規(guī)定添加1，8－桉葉油素是比較安全的。

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