復(fù)合乳酸菌對腸出血性大腸桿菌O157∶H7抑制作用的研究

王 菲，張繼倫，寧喜斌，*

(1.上海海洋大學(xué)食品學(xué)院，上海201306;2.上海出入境檢驗檢疫局，上海201202)

乳酸菌(lactic acid bacteria，LAB)是指能從發(fā)酵性碳水化合物(主要是葡萄糖)產(chǎn)生乳酸的革蘭氏陽性細(xì)菌的總稱。國內(nèi)外諸多專家研究表明大部分乳酸菌對人體具有特殊的生理調(diào)節(jié)和營養(yǎng)功能，能夠維護(hù)腸道消化系統(tǒng)健康，調(diào)節(jié)機(jī)體胃腸道正常菌群，增強(qiáng)免疫力，降低血清膽固醇，延緩機(jī)體衰老，抗腫瘤，預(yù)防癌癥等作用［1－3］。乳酸菌已廣泛應(yīng)用于乳制品、肉制品以及蔬菜的發(fā)酵與防腐中。許多乳酸菌除產(chǎn)生乳酸、乙酸、丙酸外，還能產(chǎn)生具有抑菌或殺菌的生物活性物質(zhì)，所以利用乳酸菌抑制有害微生物對保障我國人民的身體健康，改善我國食品生產(chǎn)企業(yè)的產(chǎn)品結(jié)構(gòu)以及提高其經(jīng)濟(jì)效益具有很大的促進(jìn)作用［4－5］。雖然國內(nèi)外很多研究已經(jīng)證實了某些乳酸菌對大腸埃希菌 O157∶H7的抑制作用［6］，但是它們大多集中在乳酸菌抑菌特性的研究，而對于研究具體哪幾種乳酸菌復(fù)合以及復(fù)合后這幾種乳酸菌如何配比具有最佳抑制大腸桿菌O157∶H7的效果卻很少涉及。因此，本文將實驗室保存的幾株常見乳酸菌以不同形式組合后抑制大腸桿菌O157∶H7，選取實驗得出的具有最佳抑菌效果的乳酸菌組合，將組合中幾株乳酸菌以不同比例配比后進(jìn)行抑制大腸桿菌O157∶H7，從而獲得抑制大腸桿菌 O157∶H7生長的高效復(fù)合益生菌，為今后制備益生菌制劑提供實際依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

表1 4株乳酸菌的11種不同組合形式Table 1 The 11 different composes of four lactobacillus

大腸桿菌(E scherichia coli O157∶H7)、乳酸菌:SL1(嗜酸乳桿菌，Lactobacillus acidophilus)、SL2(鼠李糖乳桿菌，Lactobacillus rhamnosus)、SL3(干酪乳桿菌，Lactobacillus casei)、SL4(植物乳桿菌，Lactobacillus plantarum)、SL5(副 干 酪 乳 桿 菌，Lactobacillus paracasei)、SL6(嗜 熱 鏈 球 菌，Streptococcus thermophilus)、SL7(短乳桿菌，Lactobacillus brevis)均為實驗室分離保存。

MRS培養(yǎng)基、營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基、伊紅美蘭培養(yǎng)基、YPD培養(yǎng)基、PBS緩沖液等均購于上海疾控中心。

Class II BSC生物安全柜 新加坡ESCO公司;臺式pH精密測試儀 德國WTW;隔水式恒溫培養(yǎng)箱 上海一恒科學(xué)儀器有限公司;不銹鋼自動手提式壓力蒸汽滅菌器 上海申安醫(yī)療器械廠;DGG－9003型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱 上海森信實驗儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 乳酸菌與E.coli O157∶H7混合培養(yǎng)

1.2.1.1 單一乳酸菌與E.coli O157∶H7混合培養(yǎng) 將實驗室保存的7株常見乳酸菌分別按5%的比例接種于YPD液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)后計數(shù)，然后分別稀釋至107cfu/mL，各取菌液100μL接種到5mL MRS液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)12h。再將E.coli O157∶H7培養(yǎng)并稀釋至107cfu/mL后轉(zhuǎn)接100μL至含有乳酸菌的MRS液體培養(yǎng)基中，在相同條件下以E.coli O157∶H7單獨培養(yǎng)作為空白對照。

1.2.1.2 復(fù)合乳酸菌與E.coli O157∶H7混合培養(yǎng) 通過上述實驗得到的幾株對E.coli O157∶H7有明顯抑制效果的乳酸菌。將這幾株乳酸菌以相同比例混合后活化稀釋至細(xì)菌總數(shù)為107cfu/mL，以下方法同1.2.1.1。

1.2.1.3 E.coli O157∶H7菌落數(shù)的測定 將1.2.1.1和1.2.1.2中單一及復(fù)合乳酸菌與E.coli O157∶H7混合培養(yǎng)的菌液，于培養(yǎng)24、48、72、96 h時分別取樣涂布于伊紅美蘭瓊脂平板，將平板置于恒溫箱內(nèi)，37℃培養(yǎng)24h后計數(shù)E.coli O157∶H7菌落數(shù)。

1.2.2 乳酸菌菌液、發(fā)酵濾液和菌體懸液抑菌實驗

1.2.2.1 乳酸菌菌液抑菌實驗 將上述實驗得到的對大腸桿菌有抑制作用的幾株乳酸菌分別接種于MRS液體培養(yǎng)基中，另外將這幾株乳酸菌以相同比例混合后同樣接種于MRS液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)24、48、72、96 h。將活化稀釋好的 E.coli O157∶H7 吸取200μL在營養(yǎng)瓊脂平板涂布，制成大腸桿菌板，無菌條件下將牛津杯放在平板上然后分別在4個培養(yǎng)時間階段下從單一乳酸菌和復(fù)合乳酸菌液中吸取200μL加入牛津杯中，每個菌株做3個平行，將平板平放至恒溫培養(yǎng)箱中，37℃培養(yǎng)24 h，測其抑菌圈直徑。

1.2.2.2 乳酸菌發(fā)酵濾液抑菌實驗 同1.2.2.1的方法，分別在培養(yǎng)24、48、72、96h時取培養(yǎng)液3000×g離心10 min后，除菌體取上清液，經(jīng)小濾器過濾(濾膜孔徑0.22μm)，收集濾液即為發(fā)酵濾液。采用牛津杯法進(jìn)行抑菌實驗，以下方法同1.2.2.1。同時測定各檢測時間段發(fā)酵濾液的pH。

1.2.2.3 乳酸菌菌體抑菌實驗 將上述離心后的菌體沉淀用PBS緩沖液(pH7.0)洗滌3次，再用生理鹽水稀釋成原菌液濃度后采用牛津杯法進(jìn)行抑菌實驗，方法同1.2.2.1。

1.2.3 不同組合的復(fù)合乳酸菌抑菌實驗 將實驗得到的對E.coli O157∶H7有抑制效果的幾株乳酸菌進(jìn)行排列組合(C(n，m))得到11種不同形式的組合(見表1)，組合中各個菌株以1∶1的比例進(jìn)行混合，每株菌分別取100μL菌液于MRS液體培養(yǎng)基中進(jìn)行混合培養(yǎng)24、48、72h。采用牛津杯法進(jìn)行抑菌實驗，每種組合做3個平行，將平板平放至恒溫培養(yǎng)箱中，37℃培養(yǎng)24 h，測其抑菌圈直徑。

1.2.4 復(fù)合乳酸菌不同配比的抑菌實驗 從上述實驗中獲取具有最佳抑菌效果的乳酸菌組合，以這個組合中幾株乳酸菌為因素，采用正交實驗中三因素三水平實驗設(shè)計方案得到9種不同形式配比的復(fù)合乳酸菌(設(shè)計方案見表2)，分別于培養(yǎng)24、48、72h時采用牛津杯法進(jìn)行抑制E.coli O157∶H7實驗，每個組合做3個平行，將平板平放至恒溫培養(yǎng)箱中，37℃培養(yǎng)24 h，測其抑菌圈直徑。

表2 3株乳酸菌的正交實驗設(shè)計方案Table 2 The orthogonal desigh of three lactobacillus

2 結(jié)果與分析

2.1 乳酸菌與E.coli O157∶H7混合培養(yǎng)

抑菌結(jié)果如表3所示，7株乳酸菌分別與E.coli O157∶H7在MRS液體培養(yǎng)基中混合培養(yǎng)，其中有4株乳酸菌對E.coli O157∶H7產(chǎn)生明顯抑制作用，分別是 SL1、SL2、SL3、SL4。E.coli O157∶H7 在與 SL1、SL2、SL3、SL4分別培養(yǎng)達(dá)到96h時，培養(yǎng)液中E.coli O157∶H7數(shù)量基本為0。其中SL3對E.coli O157∶H7的抑制效果最好，優(yōu)于另外3株乳酸菌，差異顯著(p＜0.05)。SL2在各檢測時間點的抑菌能力僅次于SL3。再將這4株乳酸菌混合后與E.coli O157∶H7共同培養(yǎng)，結(jié)果顯示混合后的乳酸菌在與E.coli O157∶H7培養(yǎng)時間達(dá)到72h時，培養(yǎng)液中E.coli O157∶H7的數(shù)量已經(jīng)為0，說明將這4株乳酸菌混合后對E.coli O157∶H7的抑制效果明顯提高，強(qiáng)于任意單獨乳酸菌的抑菌效果，差異顯著(p＜0.05)。

表3 不同培養(yǎng)時間的E.coli O157∶H7數(shù)量(lg cfu/mL)Table 3 The number of E.coli O157∶H7 at different time(lg cfu/mL)

2.2 乳酸菌菌液、發(fā)酵濾液和菌體對大腸桿菌的抑制實驗

將SL1、SL2、SL3、SL4 單獨及復(fù)合后的菌液、發(fā)酵濾液和菌體懸液，分別用牛津杯法做抑菌實驗，結(jié)果表明菌液和發(fā)酵濾液均可抑菌，經(jīng)測量，其抑菌圈大小幾乎一致，說明乳酸菌菌液與發(fā)酵濾液的抑菌能力無差異，而菌體懸液在各個檢測時間段都不具備抑菌能力，沒有抑菌圈。說明其產(chǎn)生的抑菌物質(zhì)主要存在于代謝產(chǎn)物中。4株菌單獨、混合培養(yǎng)不同時間段的發(fā)酵濾液pH見表4，隨著培養(yǎng)時間的增加各菌濾液的pH有所下降，SL2在各個培養(yǎng)時間段，測得濾液的pH較另外3株單獨乳酸菌發(fā)酵濾液的pH低，說明了4株乳酸菌中SL2的產(chǎn)酸能力最強(qiáng)。而將4株乳酸菌混合培養(yǎng)后各培養(yǎng)時間段所測得發(fā)酵濾液的pH下降最快，且明顯低于任意單獨乳酸菌的pH，說明4株乳酸菌混合培養(yǎng)后，其產(chǎn)酸能力也有了明顯提高。

2.3 不同組合的復(fù)合乳酸菌對E.coli O157∶H7生長的抑制作用

將上述實驗得到的對E.coli O157∶H7有明顯抑制作用的4株乳酸菌(SL1、SL2、SL3、SL4)通過排列組合(C(4，2)+C(4，3)+C(4，4)=11)得出 11 種不同混合形式的組合，通過牛津杯法抑菌實驗后測量抑菌圈直徑大小(結(jié)果見表5)。實驗結(jié)果表明其中第10組和第11組抑菌效果最好，明顯優(yōu)于其他9組，差異顯著(p＜0.05)，而第11組在各檢測時間點的抑菌效果都強(qiáng)于第10組，差異不顯著。分析認(rèn)為第11組由 SL2、SL3、SL4組合成的復(fù)合乳酸菌對E.coli O157∶H7的抑制效果最好。

表4 不同培養(yǎng)時間乳酸菌發(fā)酵濾液的pHTable 4 pH values of fermented filtrations of four lactobacillus cultured for different time duration

表5 4株乳酸菌不同組合對E.coli O157∶H7的抑菌圈大小(lgcfu/mL)Table 5 Zone of inhibition of the different composes of four lactobacillus on E.coli O157∶H7(lgcfu/mL)

2.4 不同的復(fù)合乳酸菌配比對E.coli O157∶H7生長的抑制作用

將上述實驗得到的具有最佳抑菌效果的乳酸菌組合(SL2、SL3、SL4)采用三因素三水平設(shè)計法，研究不同配比對E.coli O157∶H7的抑制效果。由表6可知，第1組，第4組，第7組抑菌效果比較好，相比其余6組差異顯著(p＜0.05)，其中第7組在各檢測時間點抑菌效果最強(qiáng)。分析認(rèn)為，以第7處理組(SL2、SL3、SL4 的比例為 3∶1∶3)對 E.coli O157∶H7 的抑制效果最好。

表6 3株乳酸菌不同配比對E.coli O157∶H7的抑制圈大小(lg cfu/mL)Table 6 Zone of inhibition of the different proportions from three lactobacillus on E.coli O157∶H7(lgcfu/mL)

3 結(jié)論與討論

本次實驗通過單一乳酸菌與E.coli O157∶H7混合培養(yǎng)后對E.coli O157∶H7計數(shù)得到4株對E.coli O157∶H7 有明顯抑制作用的乳酸菌(SL1、SL2、SL3、SL4)。再將這4株乳酸菌混合后對E.coli O157∶H7進(jìn)行抑制實驗，結(jié)果顯示，4株乳酸菌混合后對E.coli O157∶H7的抑制效果強(qiáng)于任意單獨乳酸菌抑菌效果，差異達(dá)顯著水平(p＜0.05)。

將SL1、SL2、SL3、SL4 單獨和混合后的菌液、發(fā)酵濾液、菌體懸液通過牛津杯法進(jìn)行抑制大腸桿菌的實驗，結(jié)果表明，乳酸菌的菌液和發(fā)酵濾液的抑菌能力無差異，而菌體懸液經(jīng)檢測沒有出現(xiàn)抑菌圈，說明乳酸菌抑菌的有效成分在代謝產(chǎn)物中。測得4株菌單獨、混合培養(yǎng)發(fā)酵濾液的pH，其中SL2在各培養(yǎng)時間段的pH低于另外3株單獨培養(yǎng)的乳酸菌發(fā)酵濾液，說明SL2產(chǎn)酸能力較強(qiáng)。而將這4株乳酸菌混合培養(yǎng)后，其各檢測時間段的發(fā)酵濾液pH下降最快，且各時間段的pH明顯低于4株單獨乳酸菌，說明這4株乳酸菌混合后的產(chǎn)酸能力也明顯增強(qiáng)。

以排列組合方式(C(n，m))將 SL1、SL2、SL3、SL4分為11種不同混合形式后對E.coli O157∶H7進(jìn)行抑制實驗，結(jié)果顯示(SL2、SL3、SL4)3株乳酸菌混合后對E.coli O157∶H7具有最佳抑制效果，再將這3株乳酸菌采用正交設(shè)計方案以不同比例混合培養(yǎng)后進(jìn)行抑制 E.coli O157∶H7實驗，結(jié)果顯示:SL2、SL3、SL4混合配比在3∶1∶3時發(fā)揮的抑菌效果最佳。

實驗中SL2、SL3、SL4 3株乳酸菌混合后對E.coli O157∶H7具有最佳抑制效果，說明這3株乳酸菌混合培養(yǎng)后具有協(xié)同作用，且代謝產(chǎn)物中產(chǎn)生更多具有抑菌活性的物質(zhì)［7］。隨著培養(yǎng)時間的增加，乳酸菌的抑菌能力也相應(yīng)提高，說明了乳酸菌在不斷繁殖時所產(chǎn)生的抑菌物質(zhì)在增加［8－9］。3株乳酸菌發(fā)揮最佳抑制作用的時間基本在48～72h。這可能與菌種的生長速度、代謝活躍的程度存在一定關(guān)系。那么，在應(yīng)用其進(jìn)行抑菌時應(yīng)注意控制添加的時間，以保證其發(fā)揮作用的有效性［10－11］。本實驗研究結(jié)果表明，乳酸菌組合(SL2、SL3、SL4)以 3∶1∶3 比例來制備復(fù)合菌劑時，對E.coli O157∶H7的抑制效果最好。這個較為理想的益生菌最佳組合，可有效預(yù)防和抑制食品中有害微生物同時還可以一定程度上發(fā)揮對人體有益的生理功能，為實際生產(chǎn)推廣應(yīng)用提供了理論依據(jù)。

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