鱸魚在微凍貯藏下品質(zhì)及優(yōu)勢腐敗菌的變化

王慧敏，王慶麗，朱軍莉

（浙江工商大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，浙江杭州310035）

養(yǎng)殖魚類富含營養(yǎng)，然而魚肉組織脆弱，水分和蛋白含量高、組織酶活躍，極易導(dǎo)致新鮮度下降及腐敗變質(zhì)。自溶酶、脂肪氧化、外源污染等因素均會引起魚肉品質(zhì)劣變，其中微生物生長及代謝形成的胺、硫化物、醛、酮和有機(jī)酸等，產(chǎn)生不良?xì)怏w和風(fēng)味，是引起腐敗的主要原因之一[1]。而溫度是影響魚類捕撈后貯藏和流通加工中品質(zhì)變化的重要因素。因此，低溫保鮮仍是目前水產(chǎn)魚類應(yīng)用最廣泛的保鮮技術(shù)，其中冷藏保質(zhì)期短，且在貯藏過程中魚肉的新鮮度下降快。而微凍保鮮技術(shù)是將新鮮魚放入低于魚肉冰點(diǎn)以下的冰凍海水中迅速冷卻，然后將魚體保存在-2～0℃區(qū)域內(nèi)保鮮[2]，該方法可有效保持魚肉的鮮度。

鱸屬鱸形目，脂科，鱸屬，在我國沿海以黃海、渤海較多分布，是重要的經(jīng)濟(jì)魚類之一。近年來，隨著鱸產(chǎn)量逐年增加，僅僅活體運(yùn)輸銷售方式很難滿足鱸魚快速增長的需求。目前鱸的保鮮研究較少，有學(xué)者已研究了低溫貯藏過程中鱸的鮮度指標(biāo)和蛋白生化指標(biāo)的變化[3-4]，并分析了鹽水超冷卻處理[5]和微凍貯藏[6]對鱸魚的新鮮度和質(zhì)構(gòu)變化。然而，從微生物角度分析鱸魚在低溫貯藏過程中細(xì)菌菌群變化還鮮有報道。鑒于此，本文通過培養(yǎng)計(jì)數(shù)和PCR-變性梯度凝膠電泳（DGGE）分析的鱸魚在冷藏和微凍條件下的菌落總數(shù)等的變化趨勢及微生物構(gòu)成，同時測定感官特性、TVB-N值、K值和pH的變化，研究微凍貯藏對鱸品質(zhì)的變化規(guī)律，探索微凍保鮮的作用機(jī)制，為養(yǎng)殖魚類的低溫貯藏保鮮新技術(shù)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

鱸魚 購于杭州市文二路農(nóng)貿(mào)市場，平均尾重（603.4±31.8）g，平均體長（28.4±0.7）cm，36尾；平板計(jì)數(shù)瓊脂（PCA）、Long-Hammer培養(yǎng)基（LH）、含鐵瓊脂（IA）、假單胞菌CFC選擇性培養(yǎng)基（CFC）、結(jié)晶紫中性紅膽鹽葡萄糖瓊脂（VRBGA）和乳酸菌培養(yǎng)基（MRS） 購買于青島海博生物有限公司；PBS緩沖液和Biospin基因組抽提試劑盒 購買于杭州昊天生物技術(shù)有限公司。

LRH-250A型生化培養(yǎng)箱 廣東省醫(yī)療器械廠；LDZM-40KCS型滅菌鍋 上海申安醫(yī)療器械廠；KJELTEC 2300型凱氏定氮儀 丹麥FOSS公司；BCD-277型西門子冰箱 博西華家用電器有限公司；DELTA 320型pH計(jì) 梅特勒-托利多儀器有限公司；HPLC 1100型高效液相色譜儀 美國安捷倫科技公司；DCodeTM型變性剃度凝膠電泳儀、Quantity One system型凝膠成像儀 美國Bio-Rad公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 樣品處理 將運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室的鮮活鱸采用冰水混合物致死，保鮮袋包裝后分成兩組，每組18尾，分別置于微凍（-2±0.1）℃和冷藏（4±0.5）℃冰箱貯藏備用。

1.2.2 感官評價 采用缺點(diǎn)評分法[7]對鱸魚的氣味、外觀、眼球、鰓和尾部、腹部、肌肉組織為指標(biāo)進(jìn)行感官評定，評定人員由經(jīng)過專門訓(xùn)練的10名人員組成，具體評分標(biāo)準(zhǔn)見表1。

1.2.3 pH測定 參考GB/T 5009.45-2003中的酸度計(jì)法，稱取10g勻漿魚肉，加入新煮沸后冷卻的雙蒸餾水90mL，拍打均勻，過濾靜置后，測定pH。

1.2.4 揮發(fā)性鹽基氮（TVB-N）測定 參考FOSS應(yīng)用子報[8]測定魚肉中的TVB-N值。TVB-N值單位為mg/100g。

1.2.5 K值測定 K值采用HPLC測定，參考John的方法[9]。

1.2.6 微生物計(jì)數(shù) 細(xì)菌總數(shù)（TVC）、產(chǎn)H2S菌、假單胞菌、腸桿菌和乳酸菌計(jì)數(shù)均采用GB 4789.2-2010平板傾注計(jì)數(shù)測定。PCA和LH[10]培養(yǎng)基測定TVC，IA培養(yǎng)基測定產(chǎn)H2S菌，CFC培養(yǎng)基測定假單胞菌，MRS瓊培養(yǎng)基分析乳酸菌，VRBGA瓊脂培養(yǎng)基分析腸桿菌。

1.2.7 PCR-DGGE分析方法 細(xì)菌總DNA的抽提：魚肉組織中細(xì)菌收集和總DNA的提取參考文獻(xiàn)[11]，LH和PCA培養(yǎng)基中細(xì)菌用PBS緩沖液洗滌2次，采用Biospin基因組總DNA，分別對鱸魚0d、品質(zhì)轉(zhuǎn)變期和貨架終點(diǎn)期的樣品提取其總DNA。采用16S rDNA的V3區(qū)進(jìn)行PCR擴(kuò)增[11]。前引物（F）：5’-ACTCCTACG GGAGGCAGCAG-3’，后引物（B）：5’-GTATTACCGC GGCTGCTGG-3’，發(fā)卡前引物（F）：5’-CGCCCGCCG CGCGCGGCGGGCGGGGCGGGGGCACGGGGGGCTC CTACGGGAGGCAGCAG-3’。50μL的反應(yīng)體系如下：前后引物各2μL，Taq酶0.5μL，10×Buffer（含Mg2+）5μL，dNTP 4μL，ddH2O 34.5μL。PCR反應(yīng)程序：94℃5min，94℃ 40s，52℃ 1min，72℃ 40s，72℃ 5min，4℃保存。DGGE分析，采用40%丙烯酰胺/甲叉雙丙烯酰胺（37.5∶1），50×TAE緩沖液，配制35%和55%變性膠溶液進(jìn)行DGGE電泳。電泳后對DGGE膠清晰明亮條帶的割膠回收DNA，進(jìn)行測序。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 13.0進(jìn)行重復(fù)測量方差分析，Origin 8.5軟件（美國OriginLab公司）繪圖，p＜0.05為差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 感官分析

圖1 鱸魚在低溫貯藏期間感官評分的變化Fig.1 Changes in sensory attributes of Lateolabrax japonicus during the refrigerated storage

表1 鱸魚感官評分表Table 1 Sensory evaluation of Lateolabrax japonicus

圖1顯示了鱸魚在不同冷藏溫度下新鮮度的感官評分變化。隨著貯藏時間延長，鱸魚在冷藏條件下感官評分明顯高于微凍貯藏的樣品（p＜0.05）。在整個冷藏過程中，感官評分隨著貯藏時間的延長而迅速增加，其中在貯藏的第3d上升顯著（p＜0.05）。鱸魚可接受貨架期時的感官評分為12，經(jīng)冷藏的樣品在第12d時感官不可接受，而微凍貯藏的樣品第18d時在感官上才達(dá)到不可接受程度。因此，微凍貯藏比冷藏能更有效的延緩鱸魚感官品質(zhì)的下降，結(jié)果與高昕等[6]結(jié)果相似。

2.2 pH

圖2 鱸魚在低溫貯藏期間pH的變化Fig.2 Changes in pH of Lateolabrax japonicus during the refrigerated storage

鱸魚的初始pH為6.96，在貯藏初期pH呈現(xiàn)先下降后逐漸升高的趨勢。其原因可能是鱸魚被猝死后，體內(nèi)的糖原被降解，生成乳酸等酸類物質(zhì)，造成肌肉pH下降，pH下降程度與肌肉中糖原的含量有關(guān)。而隨著貯藏時間的延長，冷藏3d后魚肉的pH顯著增加[14]，鮮度下降，隨著微生物的繁殖，蛋白質(zhì)被分解為氨、三甲胺、吲哚、組胺等堿性物質(zhì)，使肌肉pH上升。相對于冷藏，微凍貯藏下魚肉的pH下降得更低，而上升更緩慢。因此，微凍貯藏能有效延長魚肉僵直與解僵之間的時間。一般認(rèn)為，低溫有助于緩解魚體內(nèi)ATP的下降，從而推遲僵硬期的到來和解僵的產(chǎn)生，魚體處于僵硬期時鮮度保持較高的水平。

2.3 TVB-N

圖3 鱸魚在低溫貯藏期間TVB-N值的變化Fig.3 Changes in TVB-N of Lateolabrax japonicus during the refrigerated storage

揮發(fā)性鹽基氮（TVB-N）值是評價水產(chǎn)品品質(zhì)的重要指標(biāo)之一[12]。TVB-N主要包括魚體腐敗過程中形成的三甲胺、二甲胺、氨類和其他含氮物質(zhì)。隨著魚體死后逐步腐敗，TVB-N相應(yīng)的增加，在某些魚體中發(fā)現(xiàn)TVB-N的增加與貯藏時間呈現(xiàn)良好的線性。水產(chǎn)品品質(zhì)可被消費(fèi)者接受的TVB-N上限為30mg/100g[13]。鱸魚在不同冷藏溫度條件下TVB-N值的變化如圖1所示，魚肉貯藏初期在TVB-N的含量為10.27mg/100g，表明鱸魚鮮度良好，其結(jié)果與感官分析結(jié)果相似。魚肉中TVB-N值在貯藏的前3d無顯著變化，之后迅速升高。相對于冷藏，微凍貯藏的魚肉TVB-N增加顯著變慢（p＜0.05），可能是由于低溫抑制了魚肉優(yōu)勢腐敗菌活動，從而導(dǎo)致非蛋白化合物氧化脫氨基速度減慢。

2.4 K值

圖4 鱸魚在低溫貯藏期間K值的變化Fig.4 Changes in K value of Lateolabrax japonicus during the refrigerated storage

K值是反映水產(chǎn)品在低溫貯藏前期的鮮度變化，其以肌肉中ATP及其降解產(chǎn)物的含量為基礎(chǔ)，通過計(jì)算得到的一個指標(biāo)。Saito等[14]認(rèn)為K值小于20%時，魚肉為一級新鮮度；20%～40%時為二級新鮮度，50%為初期腐敗。鱸魚在冷藏的前3d K值增加緩慢，兩個貯藏溫度樣品均在一級新鮮度。3d后隨著貯藏時間的延長，K值迅速升高（p＜0.05），冷藏15d 的樣品K值達(dá)到48.45%，出現(xiàn)了明顯的腐敗，而微凍貯藏的樣品K值為35.56%，到18d超過40%。因此微凍貯藏能顯著的抑制鱸魚魚肉中ATP的降解（p＜0.05）。

2.5 細(xì)菌計(jì)數(shù)

鱸魚在冷藏和微凍貯藏過程中細(xì)菌計(jì)數(shù)如表2所示。結(jié)果顯示，鱸魚的初始菌落總數(shù)為2.44lg cfu/g，表明鱸魚品質(zhì)良好，與感官和化學(xué)指標(biāo)結(jié)果相似。隨著貯藏時間的延長，冷藏樣品微生物增長迅速，在9d接近6lg cfu/g，15d超過7lg cfu/g。而微凍貯藏的樣品微生物增長緩慢，在貯藏前6d維持低的細(xì)菌數(shù)，在18d細(xì)菌總數(shù)接近6log cfu/g，21d超過7lg cfu/g。研究中采用PCA和LH兩種培養(yǎng)基評價細(xì)菌總數(shù)，結(jié)果顯示LH培養(yǎng)基計(jì)數(shù)明顯多于PCA培養(yǎng)基，與Broekaert等[15]報道一致，LH等含鹽培養(yǎng)基比非含鹽培養(yǎng)基的PCA菌落總數(shù)要高許多，表明海水魚類微生物更適宜在含NaCl的培養(yǎng)基上生長。

鱸魚低溫貯藏過程中產(chǎn)H2S細(xì)菌、假單胞菌、腸桿菌和乳酸菌的變化如表2所示。鱸魚中四種細(xì)菌的初始值含量在1.08～1.65lg cfu/g，隨著貯藏時間的延長，細(xì)菌的增長趨勢與細(xì)菌總數(shù)的變化表現(xiàn)相似的增長趨勢。H2S細(xì)菌、假單胞菌、腸桿菌和乳酸菌在冷藏15d細(xì)菌數(shù)分別為7.59、6.05、5.78和5.90lg cfu/g，而在微凍貯藏21d細(xì)菌數(shù)分別為6.38、5.60、5.02和4.77lg cfu/g，兩個貯藏溫度之間細(xì)菌的增長存在顯著的差異（p＜0.05），其中冷藏條件下細(xì)菌增長快于微凍貯藏。在冷藏過程中4種細(xì)菌中產(chǎn)H2S細(xì)菌和假單胞菌增長最快，貨架期終點(diǎn)產(chǎn)H2S細(xì)菌數(shù)接近細(xì)菌總數(shù)，腸桿菌和乳酸菌次之。研究表明，養(yǎng)殖鯛在冷藏的貨架期終點(diǎn)優(yōu)勢腐敗菌鑒定為假單胞菌和西瓦氏菌[16]，腐敗西瓦氏菌和或假單胞菌是養(yǎng)殖大黃魚等冷藏魚的主要腐敗菌[17]?？梢?，鱸魚冷藏過程中H2S菌和假單胞菌是鱸冷藏過程中主要的優(yōu)勢腐敗菌，其中微動貯藏能顯著抑制優(yōu)勢腐敗菌的生長。

2.6 DGGE圖譜及序列分析

研究從不同冷藏時間的魚片和兩種培養(yǎng)基中均得到了細(xì)菌總DNA，以細(xì)菌總DNA為模板進(jìn)行擴(kuò)增，獲得目的條帶。冷藏和微凍貯藏過程中鱸魚魚肉和培養(yǎng)樣品中16S rDNA擴(kuò)增的DGGE結(jié)果如圖5所示。結(jié)果顯示，冷藏和微凍樣品微生物變化表現(xiàn)相似的趨勢，隨著貯藏時間的延長，條帶數(shù)目的增加并發(fā)生一定的變化。直接抽提DNA樣品與LH和PCA抽提的樣品中大部分條帶位置相同，培養(yǎng)后的樣品中出現(xiàn)條帶多于直接抽提樣品，主要是由于經(jīng)過培養(yǎng)后提取DNA的總量和質(zhì)量都優(yōu)于從魚肉中抽提的DNA。并且，魚肉基質(zhì)中存在的某些成分可能也會影響PCR效果。與生鮮羅非魚中細(xì)菌PCR-DGGE結(jié)果相似[18]，直接抽提DNA獲得的微生物多樣性較低。LH和PCA培養(yǎng)基抽提的DNA獲得的DGGE圖譜相比，LH培養(yǎng)具有更多條帶，表明具有更多種類的細(xì)菌在該培養(yǎng)基上生長，與計(jì)數(shù)結(jié)果相似。

將圖5中DGGE凝膠上的10個主要條帶切下，經(jīng)割膠回收試劑盒純化后，PCR擴(kuò)增進(jìn)行測序。從上述DGGE凝膠上的條帶經(jīng)測序后，獲得9個16S rDNA片段序列，提交Genbank比對分析，結(jié)果見表3。結(jié)果顯示，所獲得的序列分別屬于希瓦氏菌屬（Shewanella）、假單胞菌屬（Pseudomonas）、腸桿菌屬（Enterobacter）和奧斯陸莫拉氏菌，其中希瓦氏菌和假單胞菌屬分別占55.5%和33.3%。

圖5 鱸魚在低溫貯藏期間DGGE圖譜Fig.5 Changes in K value of Lateolabrax japonicus during storage

由PCR-DGGE圖譜及細(xì)菌計(jì)數(shù)結(jié)果可知，鱸魚有氧冷藏和微凍貯藏過程條件下的細(xì)菌群落變化和優(yōu)勢腐敗菌。希瓦氏菌屬（Shewanella.spp）和假單胞菌屬（Pseudomonas.spp）細(xì)菌在整個冷藏過程中均存在，并成為主要優(yōu)勢菌，特別是腐敗希瓦氏菌。上世紀(jì)90年代，Dalgaard[19]提出了特定腐敗菌（specific spoilage organism，SSO）的概念，水產(chǎn)品所含的微生物只有部分微生物參與腐敗過程，在冷藏中能生存并繁殖，產(chǎn)生三甲胺、胺和H2S等腐敗臭味和異味代謝產(chǎn)物的微生物就是該水產(chǎn)品特定腐敗菌。研究表明，在有氧冷藏中，魚、貝類和甲殼類的SSO多為假單胞菌或者腐敗西瓦氏菌，其中腐敗西瓦氏菌多為海洋溫帶水域的SSO，假單胞菌多為熱帶淡水魚的SSO。1985年希瓦氏菌被劃分為新的屬-希瓦式菌屬[20]，希瓦氏菌屬于嗜冷性菌、革染氏陰性、具有運(yùn)動性、非發(fā)酵型，大部分菌株能還原氧化三甲胺（TMAO）為三甲胺，產(chǎn)H2S，是水生動物和富含蛋白食品相關(guān)的典型腐敗菌[18]。產(chǎn)H2S菌在剛捕獲的魚中比例小，在貯藏中逐步成為優(yōu)勢菌，細(xì)菌數(shù)可以達(dá)到107～109CFU/g。因此，利用還原TMAO和產(chǎn)硫化氫的細(xì)菌數(shù)量可預(yù)測冰藏魚中剩余的貨架期[21]。

表2 鱸魚在低溫貯藏過程細(xì)菌的變化（lg cfu/g）Table 2 Changes in the microbiology of Lateolabrax japonicus during the refrigerated storage（lg cfu/g）

表3 DGGE割膠條帶的16S rDNA序列鑒定Table 3 Sequence and homology of Lateolabrax japonicus at 4℃

3 結(jié)論

研究結(jié)果表明，與4℃冷藏相比，-2℃微凍貯藏的鱸魚樣品感官評分和pH上升緩慢，TVB-N值、K值及細(xì)菌總數(shù)增長較慢，表明微凍貯藏能顯著減緩鱸魚品質(zhì)的劣變，延長了貨架期。微生物計(jì)數(shù)和PCRDGGE及測序結(jié)果顯示，低溫貯藏過程中鱸魚中細(xì)菌總數(shù)和產(chǎn)H2S細(xì)菌數(shù)增長趨勢相似，經(jīng)鑒定優(yōu)勢腐敗菌為腐敗西瓦氏菌和假單胞菌屬。

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