超高壓處理對牛初乳中IgG活性的影響

任 杰，胡志和，吳子健，薛 璐

（天津市食品生物技術重點實驗室，天津商業(yè)大學生物技術與食品科學學院，天津300134）

IgG是一類具有良好的免疫保護功能和生物活性物質(zhì)的球蛋白，是牛初乳中最引人注目的功能因子，也是牛初乳中最重要的免疫因子[1-2]。在人類歷史上，利用非免疫牛生產(chǎn)的初乳來預防和治療人類疾病，已有幾個世紀的歷史。雖然IgG的含量在整個泌乳期分布非常不均衡[3]，但是在初乳中含量特別高，占免疫球蛋白總量的80%～90%[4-5]。醫(yī)學和臨床研究均表明，IgG是系統(tǒng)免疫的產(chǎn)物，主要由脾臟和淋巴結(jié)中的B細胞轉(zhuǎn)化發(fā)展成的漿細胞產(chǎn)生并進入血液，然后通過乳腺組織中的主動轉(zhuǎn)移機制到達牛乳之中[6]。通過初乳的傳遞，IgG可以使那些自身免疫系統(tǒng)尚未發(fā)育健全的新生仔畜免受外來疾病的侵襲，特別是對腸道疾病和腸道微生物的侵襲提供了局部保護作用[7-8]。相比于其他類的免疫球蛋白，IgG更易擴散到血管外的間隙內(nèi)，因而在結(jié)合補體、增強免疫細胞吞噬病原微生物以及中和細菌毒素等方面能更加有效地發(fā)揮作用，抵抗外部的感染[9]。目前，作為一種生物活性蛋白質(zhì)的IgG，常常被添加到乳制品中，以其含量為決定產(chǎn)品質(zhì)量和價格的標準[10]；在不同加工處理工藝對產(chǎn)品營養(yǎng)價值影響的評價中，其含量又可作為活性蛋白質(zhì)保留或損失程度的指標[11]；在大多數(shù)的牛初乳及具有免疫功能的乳制品開發(fā)和加工過程中，都會對其質(zhì)量濃度進行檢測[12-13]。

IgG的檢測方法有多種，主要有分離層析法、電泳法、免疫學法和物理法等[14]，其中酶聯(lián)免疫法檢測牛初乳中的IgG活性，檢測結(jié)果快速、準確，靈敏度高[15-16]。本實驗從探討牛初乳營養(yǎng)價值的角度出發(fā)，研究不同的超高壓處理條件對牛初乳中IgG活性的影響，采用酶聯(lián)免疫法對其進行檢測，為牛初乳制品的研究和開發(fā)提供了科學參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

牛初乳（產(chǎn)犢48h內(nèi)） 由天津市武清區(qū)德興隆奶業(yè)有限公司提供；NaCl等生化試劑 分析純級，天津市化學試劑批發(fā)公司；ELISA檢測試劑盒 牛免疫球蛋白G（IgG）酶聯(lián)免疫試劑盒，購自深圳慧嘉生物科技有限公司；試劑盒包括封板膜、密封袋、用純化的抗原包被的ELISA反應板、標準品、標準品稀釋液、樣品稀釋液、辣根過氧化物酶標記的抗原、顯色劑A液、顯色劑B液、終止液、濃縮洗滌液。

HPP.L3-600/0.6超高壓設備 天津市華泰森淼生物工程技術有限公司；RT-6000酶標分析儀 深圳雷杜生命科學股份有限公司；VELP漩渦振蕩器 德祥科技有限公司；循環(huán)水式多用真空泵 鄭州長城科工貿(mào)有限公司；塑料薄膜封口機 浙江江南實業(yè)有限公司。

1.2 樣品的超高壓處理

量取5mL左右的生鮮牛初乳裝于聚乙烯塑料袋內(nèi)，真空密封后進行超高壓處理，將處理后的牛初乳稀釋一定倍數(shù)后待用，檢測樣品中IgG的活性。其中，對照組樣品為常壓下的牛初乳。

1.2.1 壓力大小對牛初乳中IgG的影響 施壓溫度維持在30℃，保壓時間為20min，分別選取0.1、100、200、300、400、500、600MPa的壓力條件處理牛初乳，依照IgG的活性檢測方法，在450nm下測得樣品的吸光度值，計算樣品的活性提高率。

1.2.2 施壓溫度對牛初乳中IgG的影響 在處理壓力為350MPa，保壓時間為20min，分別選取20、25、30、35、40℃的溫度條件處理牛初乳，依照IgG的活性檢測方法，在450nm下測得的吸光度值，計算樣品的活性提高率。

1.2.3 保壓時間對牛初乳中IgG的影響 在處理壓力為350MPa，施壓溫度為30℃，分別選取0、10、20、30、40、50、60min的保壓時間處理牛初乳，依照IgG的活性檢測方法，在450nm下測得樣品的吸光度值，計算樣品的活性提高率。

1.2.4 超高壓處理對牛初乳中IgG活性影響的條件優(yōu)化 選用處理壓力、施壓溫度和保壓時間作為實驗因素，進行正交實驗L9（33），選取樣品處理后活性提高較大的壓力、溫度和時間組合。正交實驗設計見表1。

表1 L9（33）正交實驗因素水平表Table 1Factors and levels table of L9（33）orthogonal experiment

1.3 IgG的活性檢測

1.3.1 IgG標準品的檢測 在用純化的抗原包被的ELISA反應板上設標準品孔，按順序加入標準品及標準品稀釋液，稀釋后各孔加樣量為50μL，濃度分別為24、16、8、4、2μg/mL，每個溶度均設置三個平行。根據(jù)酶標儀讀出OD450nm值，以IgG的質(zhì)量濃度為橫坐標，以吸光度值為縱坐標，繪制不同質(zhì)量濃度的IgG標準曲線。

1.3.2 牛初乳中IgG活性的檢測 在酶標包被板上待測樣品孔中先加樣品稀釋液40μL，然后再加稀釋100倍后的待測樣品10μL，封板后37℃溫育30min，板清洗5次（每次清洗時，每個孔都加滿洗滌液，然后靜置30s，倒掉洗滌液后用力拍干），加50μL酶標試劑至每個孔，空白孔除外，再次封板，37℃溫育30min，板再次清洗5次（同上）。結(jié)束后，每個孔先加入顯色劑A 50μL，再加入顯色劑B 50μL，混勻后37℃避光顯色15min，加50μL終止液至每個孔以終止反應，將酶標板置于酶標儀中于450nm下測定吸光度值。每個樣品平行測定三次，取平均值。樣品最終的稀釋度為500倍。

1.4 活性提高率的計算

計算公式如下：

活性提高率（%）=（超高壓處理后樣品的IgG含量-對照組樣品的IgG含量）/對照組樣品的IgG含量×100

式中：對照組樣品在0.1MPa下處理。

1.5 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)分析和圖表制作利用軟件Excel 2007。

2 結(jié)果與分析

2.1 標準曲線的繪制

按照1.3.1方法進行檢測，結(jié)果如圖1所示。

圖1 ELISA試劑盒測定牛初乳中IgG的標準曲線Fig.1 The standard curve of determination of immunoglobulin G in bovine colostrum by ELISA Kit

由圖1可見，經(jīng)ELISA試劑盒測定牛初乳中IgG的吸光度值，所獲得的標準曲線方程為：y=0.0769x-0.0351，相關系數(shù)為：R2=0.9986，說明在所測的濃度的范圍內(nèi)標準曲線的相關性較好。

2.2 壓力大小對牛初乳中IgG的影響

圖2 壓力對牛初乳中IgG的影響Fig.2 Effect of pressure on immunoglobulin G of bovine coloctrum

由圖2可以看出，與常壓下的對照組相比，經(jīng)過超高壓處理后，IgG的活性明顯提高。當壓力從常壓逐漸升高到200MPa時，隨著壓力的增大，IgG的活性也隨之增大。其中在200MPa時，牛初乳中IgG的含量值為4.9441mg/mL，與常壓下IgG含量值為2.7445mg/mL相比，活性提高率為80.15%，在所測的壓力范圍內(nèi)，達到最大值。當壓力從200MPa繼續(xù)上升至600MPa時，隨著壓力升高，牛初乳中IgG活性的增加量減小，活性提高率雖然呈現(xiàn)出下降的趨勢，但變化平緩，即使在600MPa時，牛初乳中IgG的含量值為4.5501mg/mL，與對照組比較，活性提高率為65.79%。

2.3 施壓溫度對牛初乳中IgG的影響

圖3 溫度對牛初乳中IgG的影響Fig.3 Effect of temperature on immunoglobulin G of bovine coloctrum

由圖3可以看出，經(jīng)過超高壓處理以后，與常壓下的對照組相比，牛初乳中IgG的活性均增大，而且IgG的活性變化與超高壓處理的溫度有很大的關系。在20～25℃的范圍內(nèi)，隨著溫度的升高，牛初乳中IgG活性的增加量減少，當施壓溫度為25℃時，樣品中IgG的含量值為4.3329mg/mL，常壓下樣品中IgG的含量值為2.7464mg/mL，活性提高率為57.77%。在所測溫度范圍內(nèi)，25℃時活性增加量最小。繼續(xù)升高溫度，在25℃到40℃這段溫度范圍內(nèi)，IgG的活性隨著溫度的升高而增大。尤其是在25～35℃之間，活性變化曲線近似為線性關系，上升趨勢明顯，而從35～40℃的溫度變化范圍內(nèi)，曲線逐漸趨于平緩。其中，在35℃時牛初乳中IgG的含量值為5.0364mg/mL，活性提高率為83.38%，40℃時測得IgG的含量值為5.1222mg/mL，活性提高率為86.51%。

2.4 保壓時間對牛初乳中IgG的影響

圖4 時間對牛初乳中IgG的影響Fig.4 Effect of time on immunoglobulin G of bovine coloctrum

圖4顯示，牛初乳中的IgG經(jīng)過超高壓處理以后活性明顯提高，而且在所測時間范圍內(nèi)，IgG的活性隨著保壓時間的延長而逐漸增大。當保壓時間在0～30min時，活性變化率曲線直線上升，活性增加較大；常壓下測得牛初乳中IgG的含量值為2.7445mg/mL，而保壓時間為30min時，測得牛初乳中IgG的含量值為4.9096mg/mL，與對照組相比，活性提高率為78.89%。當保壓時間在30～60min范圍內(nèi)時，活性隨著保壓時間的延長繼續(xù)增大，但提高率曲線的增幅減小，上升的趨勢變得平緩。當保壓時間達到了60min時，測得牛初乳中IgG的含量值為5.1651mg/mL，與對照組相比，活性提高率為88.20%，但與保壓時間為30min相比，IgG的活性提高率僅改變了9.31%，說明保壓時間在30～60min時間范圍內(nèi)，延長保壓時間對IgG的活性影響不大。

2.5 超高壓處理對牛初乳中IgG活性影響的條件優(yōu)化

表2 L9（33）條件優(yōu)化實驗結(jié)果Table 2 The test results of optimization

由正交表分析k值可得，三個因素中均為第2個水平的數(shù)值最高，最優(yōu)組合為A2B2C2，即為500MPa、35℃、20min；由極差分析結(jié)果可知：RA＞RC＞RB，因此上述三種影響因子對牛初乳中IgG活性的作用大小順序為壓強、時間、溫度。

根據(jù)優(yōu)化條件進行重復驗證實驗，IgG活性的OD450nm值為0.8367，活性提高率為105.08%。該檢測結(jié)果與正交表中第5組組合（500MPa，35℃，25min）結(jié)果（106.42%）相比，提高率相近，無顯著差異，所存在差異可能為檢測誤差。因此，優(yōu)化條件為500MPa、35℃、20min，在該條件下處理牛初乳，其IgG活性將大幅提高。

3 討論

IgG分子是由通過兩個二硫鍵（-S-S-）相連接的兩條輕鏈（L鏈）和兩條重鏈（H鏈）所組成[17]，其結(jié)構(gòu)區(qū)域又可分為位于C端的穩(wěn)定區(qū)（C區(qū)）和位于N端的可變區(qū)（V區(qū)），其中可變區(qū)域是由輕鏈和重鏈末端所組成的，又可分為超變區(qū)（HVR）和骨架區(qū)，抗原與抗體發(fā)生特異性結(jié)合反應的位置就是在此超變區(qū)域，通過改變超變區(qū)域段的結(jié)構(gòu)形狀從而實現(xiàn)對不同抗原的識別作用，達到被動或主動免疫的目的[18]。

Masuda T等[19]采用SDS凝膠電泳檢測牛初乳中的免疫球蛋白的研究表明：IgG對高壓處理具有抵抗性，在室溫條件下、保壓時間為10min，當施加壓強小于400MPa時，免疫球蛋白幾乎沒有影響。Felipe X等[20]研究表明，免疫球蛋白即使在壓力為500MPa、溫度為25℃的條件下都不會發(fā)生變性，只有更高的壓力和溫度才會導致其發(fā)生變性。張和平等[21]采用熒光分光光度計法在284nm激發(fā)波長條件下溶液的最大發(fā)射波長和熒光強度來檢測IgG，其中IgG的處理壓強為200～700MPa、保壓時間為20min、施壓溫度為室溫，研究表明，其他物質(zhì)如蔗糖的存在對IgG發(fā)生變性具有保護作用，而且物質(zhì)的濃度越大，IgG在高壓下的穩(wěn)定性越好。

程金波等[22]采用不同的加熱方式處理牛奶，通過雙抗體夾心法ELISA方法檢測乳中IgG的含量，結(jié)果顯示，乳品工業(yè)中常用的巴氏殺菌對于牛乳中的IgG影響并不大，在63℃的條件下處理30min，IgG的活性幾乎不受任何影響，即使在75℃溫度下處理15s，乳中IgG的變性率也僅約為9.3%。Indyk HE等[23]采用光學生物傳感器免疫測定技術，利用同步檢測牛體內(nèi)抗IgG的抗體和蛋白質(zhì)G的含量來檢測IgG的活性，研究發(fā)現(xiàn)，IgG在溫度高于60℃時才表現(xiàn)出對熱不穩(wěn)定的狀態(tài)。岳喜慶等[24]在研究牛初乳免疫球蛋白體外穩(wěn)定性的實驗中觀察到，牛初乳免疫球蛋白在低于65℃的范圍內(nèi)具有較高的熱穩(wěn)定性，其中，他是采用瓊脂雙向免疫擴散法檢測牛初乳中免疫球蛋白。趙玉娟[25]采用硫酸銨鹽析法分離提取出免疫球蛋白，繼而采用試管凝集法測其含量，研究證實，在溫度低于60℃時，免疫球蛋白的穩(wěn)定性較好。

4 結(jié)論

在實驗條件范圍內(nèi)，牛初乳經(jīng)過超高壓處理后，在優(yōu)化條件（壓強為500MPa、施壓溫度為35℃、保壓時間為20min）下處理牛初乳，其IgG的活性有很大提高。Indyk HE等[23]研究還表明，溫和的熱處理和加壓處理對牛初乳中的IgG活性具有促進作用。這與本實驗所得結(jié)果一致。無論是升高溫度、壓強，還是延長保壓時間，牛初乳中IgG的含量均呈增加的趨勢，這是因為超高壓處理改變了IgG的分子結(jié)構(gòu)，可變區(qū)域的結(jié)構(gòu)形狀也隨之發(fā)生變化，使之更易與抗原發(fā)生特異性結(jié)合反應，或與之結(jié)合的更加緊密，導致了吸光度的增加，活性的增強。因此，適當?shù)母邏禾幚砀纳屏嗣庖咔虻鞍椎幕钚裕岣吡伺３跞榈拿庖吖δ堋?/p>

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