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    成纖維細胞生長因子2對創(chuàng)傷后應激障礙模型大鼠行為及海馬星形膠質(zhì)細胞的影響

    2013-05-14 11:23:15王莉穎翟明珠王玉同
    中華老年多器官疾病雜志 2013年4期
    關鍵詞:曠場星形膠質(zhì)

    夏 亮, 王莉穎, 翟明珠, 吳 迪, 王玉同, 朱 霞*

    (第四軍醫(yī)大學: 1心理學教研室; 2人體解剖與組織胚胎學教研室; 3西京醫(yī)院急診科, 西安 710032)

    創(chuàng)傷后應激障礙(posttraumatic stress disorder,PTSD)是一種嚴重的災難性事件或威脅(如戰(zhàn)爭及自然災害等)所引發(fā),其主要癥狀為反復發(fā)生的闖入性記憶再體驗、回避及持續(xù)的警覺性增高癥候群[1]。眾多文獻報道,目前主要治療PTSD的抗抑郁藥物能增加海馬內(nèi)星形膠質(zhì)細胞的活性。作為大腦中數(shù)量較多的細胞,星形膠質(zhì)細胞如何參與PTSD的發(fā)生機制仍不清楚。本實驗采用單次延長應激(single-prolonged stress,SPS)建立大鼠PTSD模型,利用膠質(zhì)纖維酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein,GFAP)表達作為星形膠質(zhì)細胞活化的指標,通過研究海馬內(nèi)GFAP的表達變化,來探討海馬星形膠質(zhì)細胞是否參與PTSD的發(fā)病過程,并探討成纖維細胞生長因子2(fibroblast growth factor 2,F(xiàn)GF2)在治療PTSD的焦慮或抑郁樣行為中的作用。

    1 材料與方法

    1.1 實驗動物

    健康雄性SD大鼠(均由第四軍醫(yī)大學動物實驗中心提供),體質(zhì)量在250~300g,鼠齡均為8周,各組動物的數(shù)量如圖1所示。

    1.2 動物模型的建立與FGF2給藥

    根據(jù)SPS方法建立模型[2],即首先對大鼠進行2h的緊密束縛,隨后進行15min的強迫游泳,直至大鼠暫時喪失運動功能,休息10min后進行乙醚麻醉至意識喪失,然后把動物放回鼠籠靜養(yǎng)。正常大鼠在SPS期間禁食水。在建立SPS模型后第7d(SPS 7d)清晨,給予腹腔注射FGF2因子(Protech公司,美國),其劑量為50μg/kg大鼠體質(zhì)量。單次給藥結束后,將動物放回飼養(yǎng)室。在建立SPS模型后第14d(SPS 14d)時,將三組動物(正常、SPS 14d和SPS+FGF2組大鼠)給予行為學檢測后處死,按照免疫組化和Western印跡法取材。

    1.3 行為測定

    (1)曠場實驗:根據(jù)Blokland方法[3],在直徑為1.5m×1.5m的黑暗曠場上方放置攝像頭,監(jiān)視動物在曠場內(nèi)的活動情況,采集視頻后由軟件計算分析各項行為指標。具體為將大鼠放在曠場觀察箱中,給予10s的適應期后,開始記錄大鼠行為15min,分析大鼠在中央的活動時間及距離。(2)高架十字迷宮實驗(elevated plus maze,EPM):參照Komada等[4]的方法,采用上海移數(shù)公司分析系統(tǒng)分析動物的各項行為指標。實驗開始時將大鼠放于EPM的中央平臺上,且鼠頭統(tǒng)一朝向?qū)乳_臂,5s適應期后,開始記錄其行動5min,記錄大鼠在開臂停留時間占總時間百分比以及大鼠進入開臂的次數(shù)百分比等行為學指標,在SPS造模結束后7d時測試正常組和SPS組的EPM和曠場實驗,并且在SPS造模結束14d時測試正常組、SPS組和SPS+FGF2組的EPM和曠場實驗。

    1.4 免疫熒光染色

    造模結束后第14d取腦切片,大鼠經(jīng)生理鹽水、4%多聚甲醛灌注,取腦并置于4%多聚甲醛溶液中后固定4~6h,移入30%蔗糖PBS溶液中4℃保存。待標本沉底后作腦冠狀連續(xù)冰凍切片,片厚30μm。每只動物取連續(xù)5張切片,進行GFAP的免疫熒光染色。切片用0.01mol/L PBS漂洗3×10min后,分別加入單克隆小鼠抗GFAP(1∶4000,Chemicon公司)和單克隆小鼠抗NeuN(1∶4000,Chemicon公司)4℃孵育48h后,再放在搖床上孵育過夜;孵育后用0.01mol/L的PBS漂洗3×10min,加入驢抗小鼠Alexa 488在室溫下孵育6h;用PBS漂洗3×10min后,使用熒光封片劑封片,熒光共聚焦顯微鏡(FV1000,奧林巴斯)拍照,為減少誤差,所有組的切片都在相同染色和拍照條件下進行。三組動物均在SPS 14d時取腦進行免疫熒光染色。

    1.5 Western印跡法測定蛋白

    按照實驗分組,將大鼠快速開顱取腦,冰上分離海馬,加入含PMSF的單去污裂解液,勻漿裂解30min,將勻漿裂解液移入2.0ml離心管,13000×g、4℃離心5min,留取上清液,分裝于0.5ml離心管,BCA法進行蛋白濃度測定,確定含10μg蛋白的上樣體積。蛋白樣品采用10%的SDS-PAGE進行電泳分離,加入預染Marker,根據(jù)預染Marker的位置確定所需蛋白GFAP、NeuN及β-actin的位置,將所需蛋白條帶剪下,然后將膠上蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜上做免疫雜交反應(PVDF膜預先在甲醇中浸泡5min)。用含5%的脫脂奶粉的封閉液4℃過夜,然后加入鼠抗GFAP抗體(1∶4000,Chemicon公司),鼠抗β-actin(1∶100,Santa Cruz公司),4℃過夜后使用TBST洗膜,加入驢抗鼠Alexa Fluor 488(1∶500,Santa Cruz公司)對GFAP標記的膜進行孵育2h,加入驢抗鼠的Alexa Fluor 594(1∶500,Santa Cruz公司)對另外一張NeuN標記的PVDF膜進行孵育2h。后用TBST進行洗滌,10min/次,共3次。最后在博士德公司的Bio-Rad成像系統(tǒng)中進行熒光條帶的掃描,并使用該軟件進行分析,分析熒光密度值,以GFAP或NeuN與β-actin的熒光密度值之比來比較GFAP或NeuN蛋白的表達量。正常組和SPS+FGF2組均在SPS 14d時進行取材,而SPS組在SPS 7d和SPS 14d分別取材。

    1.6 圖像分析

    使用激光共聚焦成像系統(tǒng)對海馬GFAP免疫陽性星形膠質(zhì)細胞拍照,計算單個視野下GFAP陽性細胞的數(shù)量。每個部位隨機測試8張切片,每張切片選取8~12個視野(每1個視野面積約為50000μm2)。

    1.7 統(tǒng)計學處理

    采用SPSS13.0軟件進行統(tǒng)計學分析,行為學和形態(tài)學結果用均數(shù)±標準差(±s)表示,均數(shù)比較采用ANOVA分析,組間兩兩比較采用LSD檢驗。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

    2 結 果

    2.1 各組大鼠曠場實驗結果比較

    SPS 7d組和SPS 14d組大鼠在曠場實驗中的中央停留距離和中央停留時間均顯著低于正常組(均P<0.01)。正常SPS+FGF2給藥組與正常組在曠場實驗中的兩指標的差異無統(tǒng)計學意義(圖1A和B)。

    2.2 各組大鼠EPM實驗結果比較

    與正常組相比,SPS 7d組和SPS 14d組大鼠在EPM中的開臂進入次數(shù)百分比和開臂停留時間百分比顯著降低。與SPS 14d相比,SPS+FGF2給藥組開臂進入次數(shù)百分比和開臂停留時間百分比顯著升高(均P<0.01;圖1C和D)。

    2.3 GFAP和NeuN在海馬的免疫熒光表達分析

    應用免疫熒光標記技術檢測GFAP在海馬的表達情況。GFAP陽性細胞呈綠色。在正常組及SPS+FGF2組中,海馬出現(xiàn)大量GFAP陽性細胞(圖2C和F),并且所有這些陽性細胞都是星形膠質(zhì)細胞(圖2)。與此相比,SPS 組大鼠海馬內(nèi)GFAP陽性細胞數(shù)目明顯減少(圖2B和E)。提示SPS模型組顯著抑制海馬星形膠質(zhì)細胞的活性。正常組(圖2A和D)與SPS+FGF2組(圖2C和F)海馬星形膠質(zhì)細胞數(shù)目接近。而神經(jīng)元特異性標記物NeuN的表達在三組中的差異無統(tǒng)計學意義。熒光強度分析結果表明,SPS組大鼠海馬區(qū)的GFAP熒光強度與正常組和SPS+FGF2組的差異有非常顯著統(tǒng)計學意義(P<0.01),其表達明顯降低,而海馬區(qū)NeuN的熒光強度結果在三組間的差別無統(tǒng)計學意義(P>0.05;表1)。

    2.4 GFAP和NeuN的Western印跡法結果分析

    Western印跡法檢測GFAP含量(熒光密度值),結果顯示:與正常組比較,SPS 7d組GFAP表達明顯減少[(0.957±0.070)vs(0.365±0.055),P<0.01];SPS 14d組GFAP的表達(0.297±0.050)也明顯減少(P<0.01);SPS+FGF2組的GFAP(0.939±0.076)與正常組的差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05;圖3);同時,本實驗發(fā)現(xiàn)SPS 7d與SPS 14d組間GFAP表達的差異也無統(tǒng)計學意義。Western印跡法檢測NeuN含量的結果顯示,正常組、SPS 7d組、SPS 14d 組和SPS+FGF2組的差異均無統(tǒng)計學意義(圖3)。

    圖1 各組大鼠曠場實驗及EPM實驗結果比較Figure 1 Comparison of results in the open field test and elevated plus maze test in all groups

    3 討 論

    神經(jīng)膠質(zhì)細胞是神經(jīng)組織中非常重要的一大類細胞群體。而目前認為星形膠質(zhì)細胞在大腦信息處理及與神經(jīng)元構成神經(jīng)網(wǎng)絡連接的過程中發(fā)揮重要作用[5],一個星形膠質(zhì)細胞能與多個神經(jīng)元進行信息交流,而且它們在將營養(yǎng)物質(zhì)運輸?shù)侥X中起到了關鍵作用,而任何通過血腦屏障的化學物質(zhì)或藥物都必須首先與星形膠質(zhì)細胞進行接觸[6,7]。近年的最新研究表明,星形膠質(zhì)細胞在抑郁癥的發(fā)生中發(fā)揮重要作用[8-10],而且在臨床研究發(fā)現(xiàn)抑郁癥患者的GFAP的表達明顯減少[11,12]。但星形膠質(zhì)細胞是否參與PTSD的發(fā)病過程,目前國際上尚無相關報道。在本研究中,SPS模型組海馬GFAP免疫反應陽性的星形膠質(zhì)細胞數(shù)目明顯減少,且GFAP蛋白表達明顯降低,通過FGF2給藥后,PTSD模型大鼠的焦慮或抑郁樣行為明顯減輕,伴隨GFAP的表達上調(diào),由此可見,海馬星形膠質(zhì)細胞在PTSD發(fā)病過程中起重要作用。

    圖2 各組大鼠海馬區(qū)GFAP和NeuN免疫熒光染色Figure 2 Immunofluorescent staining of GFAP and NeuN (green)in rat hippocampus (scale bar: 100μm)

    表1 各組大鼠海馬區(qū)GFAP和NeuN熒光強度分析Table 1 Immunofluorescence intensity of GFAP and NeuN in rats hippocampus of three groups (n=6,±s)

    表1 各組大鼠海馬區(qū)GFAP和NeuN熒光強度分析Table 1 Immunofluorescence intensity of GFAP and NeuN in rats hippocampus of three groups (n=6,±s)

    注: 與正常組比較, **P<0.01; 與SPS 14d組比較, #P<0.05

    組別 GFAP NeuN正常組 93.12±9.63 183.12±27.68 SPS 14d組 41.35±7.64** 173.12±24.45 SPS+FGF2組 83.12±8.37# 193.12±18.32

    圖3 海馬組GFAP和NeuN表達的Western印跡結果圖Figure 3 Western blot analysis of GFAP and NeuN expression in hippocampus

    本實驗同時觀察到,SPS組大鼠在曠場實驗中的中央停留路程、中央活動時間明顯減少,EPM迷宮實驗結果顯示SPS大鼠開臂進入次數(shù)的百分比和開臂停留時間百分比均明顯縮短,說明SPS大鼠的探究行為受到抑制,回避和恐懼、焦慮水平增高,環(huán)境適應能力下降,這些癥狀都與PTSD發(fā)病的核心癥狀相似,與既往研究結果一致[13]。研究表明,腦室注射FGF2能明顯改善大鼠抑郁狀態(tài)[14,15],而全身性的皮下注射FGF2同樣能減少大鼠的恐懼記憶的鞏固,并促進恐懼記憶的消退[16]。本研究采用高劑量單次FGF2腹腔注射,F(xiàn)GF2是否能通過血腦屏障進行到腦區(qū)發(fā)揮作用成了關鍵問題,而文獻表明FGF2作為一種生長因子,能通過血腦屏障發(fā)揮作用[17]。研究發(fā)現(xiàn),內(nèi)源性FGF2能增加星形膠質(zhì)細胞的表達[18],我們的研究結果說明FGF2可能成為新型的PTSD的治療藥物,其機制為調(diào)節(jié)了GFAP的表達來實現(xiàn)。

    本研究提示FGF2通過激活海馬星形膠質(zhì)細胞來參與PTSD的治療過程。但是FGF2通過何種途徑進入海馬區(qū),而且如何調(diào)節(jié)星形膠質(zhì)細胞的活性,這些問題還有待進一步研究。

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