流體剪切力與17—β雌二醇對(duì)MC3T3—E1細(xì)胞增殖活性協(xié)同作用的研究

商思霞　尹琳琳　孫惠強(qiáng)等

[摘要] 目的 探討對(duì)體外培養(yǎng)的成骨細(xì)胞增殖活性促進(jìn)作用最佳的17-β雌二醇的濃度及作用時(shí)間、流體剪切力（FSS）的力值及作用時(shí)間，以及此雙因素共同作用對(duì)成骨細(xì)胞增殖活性的影響。方法 成骨細(xì)胞系MC3T3-E1細(xì)胞

傳代培養(yǎng)后，分別對(duì)其施加不同濃度的17-β雌二醇和不同力值的FSS，采用MTT法檢測(cè)細(xì)胞的增殖情況，并檢測(cè)ALP活性，篩選出最佳的濃度及力值；再將二者共同作用于MC3T3-E1細(xì)胞，檢測(cè)其增殖情況和ALP活性。結(jié)果 濃度為10-8 mol·L-1的17-β雌二醇作用5 d時(shí)，MC3T3-E1細(xì)胞的增殖及ALP活性優(yōu)于其他17-β雌二醇處理組；FSS力值為12×10-5 N作用60 min時(shí)細(xì)胞的增殖及ALP活性大于其他FSS處理組。當(dāng)二者同時(shí)作用于MC3T3-E1細(xì)胞時(shí)，細(xì)胞的增殖活性大于任一單因素處理組。結(jié)論 17-β雌二醇和FSS對(duì)成骨細(xì)胞活性的促進(jìn)作用皆有一個(gè)適宜的閾值；二者具有協(xié)同作用，對(duì)成骨細(xì)胞分化及增殖功能的影響優(yōu)于單一因素作用。

[關(guān)鍵詞] 17-β雌二醇； 流體剪切力； 協(xié)同作用； 成骨細(xì)胞

[中圖分類(lèi)號(hào)] Q 25 [文獻(xiàn)標(biāo)志碼] A [doi] 10.7518/hxkq.2013.01.016 正常狀態(tài)下骨形成與骨吸收處于一種平衡狀態(tài)，該平衡是由成骨細(xì)胞介導(dǎo)的新骨形成和破骨細(xì)胞介導(dǎo)的骨吸收作用來(lái)實(shí)現(xiàn)的。MC3T3-E1細(xì)胞株是成骨分化研究中的經(jīng)典細(xì)胞株，很多學(xué)者將其用于骨形成機(jī)制的研究[1]。影響成骨及破骨細(xì)胞增殖及活性的因素有很多，雌激素和應(yīng)力是影響成骨細(xì)胞活性及增殖的重要因素[2]。

研究[3-4]表明：雌激素對(duì)成骨細(xì)胞的功能有促進(jìn)作用。還有學(xué)者[5]發(fā)現(xiàn)：流體剪切力（fluid shear stress，F(xiàn)SS）能夠活化成骨細(xì)胞的跨膜受體，促進(jìn)成骨細(xì)胞增

殖。Yeh等[6]通過(guò)研究證實(shí)：雌激素可以通過(guò)雌激素受體增加成骨細(xì)胞對(duì)FSS的敏感性。本實(shí)驗(yàn)采用MC3T3-E1成骨細(xì)胞系，對(duì)其施加不同濃度的17-β雌二醇及不同力值的FSS，探討17-β雌二醇、FSS以及二者共同作用對(duì)成骨細(xì)胞增殖活性的影響。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

MC3T3-E1第3代細(xì)胞株（ADCC公司，美國(guó)）。17-β雌二醇、二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）、MTT（Sigma公司，美國(guó)），胰蛋白酶（Gibco公司，美國(guó)），含105 U·L-1青霉素及100 mg·L-1鏈霉素的α-MEM培養(yǎng)基、胎牛血清（Gibco公司，美國(guó)），堿性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）試劑盒（南京建成生物有限公司），Triton X-100（Fluka公司北京原生生物

技術(shù)有限公司分裝）。Multiskan MK3酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀（Thermo公司，美國(guó)），平行板流室加力裝置（四川大學(xué)華西口腔醫(yī)學(xué)院FSS課題組提供）。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)及傳代

將第3代MC3T3-E1細(xì)胞系用α-MEM培養(yǎng)基（含體積分?jǐn)?shù)為10%胎牛血清、105 U·L-1青霉素及100 mg·L-1鏈霉素）在37 ℃、5%CO2潮濕環(huán)境下培養(yǎng)，2～3 d換

液1次，待細(xì)胞均勻一層鋪滿培養(yǎng)瓶底部時(shí)，用0.25%胰蛋白酶消化獲得細(xì)胞，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 17-β雌二醇處理分組 將用于17-β雌二醇處理的細(xì)胞等分為A、B、C、D、E共5組，每組再分為4個(gè)小組，分別標(biāo)記為A1、A2、A3、A4、B1、B2、B3、B4……以此類(lèi)推。在A、B、C、D組的培養(yǎng)基中分別添加濃度為10-10、10-9、10-8、10-7 mol·L-1的17-β雌二醇，每一大組的4個(gè)小組分別培養(yǎng)1、3、5、7 d。E組為對(duì)照組，不加17-β雌二醇，其余處理同實(shí)驗(yàn)組。設(shè)置30個(gè)重復(fù)樣本。

1.3.2 FSS處理分組 將用于FSS處理的細(xì)胞等分為a、b、c、d、e、f共6組，每組再分為3個(gè)小組，分別標(biāo)記為a1、a2、a3、b1、b2、b3……以此類(lèi)推。將各組細(xì)胞接種于放置在六孔板中的蓋玻片上，移入細(xì)胞培養(yǎng)箱靜置培養(yǎng)至細(xì)胞完全貼壁。采用平行板流室加力裝置分批次對(duì)a、b、c、d、e組細(xì)胞分別施加每平方厘米力值為2×10-5、6×10-5、12×10-5、20×10-5、25×10-5 N的力，每組中3個(gè)小組的作用時(shí)間分別為15、60、120 min。f組為對(duì)照組，不施加FSS，其余處理同實(shí)驗(yàn)組。設(shè)置30個(gè)重復(fù)樣本。

1.3.3 FSS+17-β雌二醇雙因素處理分組 經(jīng)上述實(shí)驗(yàn)篩選出17-β雌二醇的最佳濃度和最佳培養(yǎng)天數(shù)后，設(shè)置雙因素作用組Ⅰ、FSS組Ⅱ、17-β雌二醇組Ⅲ、對(duì)照組Ⅳ。各組細(xì)胞的接種方法同1.3.2，其中Ⅰ、Ⅲ組添加最佳濃度的17-β雌二醇進(jìn)行培養(yǎng)，Ⅱ、Ⅳ組添加等量DMSO培養(yǎng)，常規(guī)培養(yǎng)經(jīng)1.3.1步驟篩選出的最佳天數(shù)后，Ⅰ、Ⅱ組施加經(jīng)1.3.2步驟篩選出的最佳力值及時(shí)間。設(shè)置30個(gè)重復(fù)樣本。

1.3.4 MTT檢測(cè) 在規(guī)定時(shí)間內(nèi)，將實(shí)驗(yàn)樣本用0.25%胰蛋白酶消化獲取懸浮細(xì)胞，將細(xì)胞分別置于EP管離心5 min，接種于96孔板中，添加適量培養(yǎng)基，靜置培養(yǎng)6 h至細(xì)胞完全貼壁后，每孔加入5 g·L-1的MTT溶液20 μL，37 ℃繼續(xù)孵育4 h，終止培養(yǎng)，小心吸棄孔內(nèi)培養(yǎng)上清液，每孔加入150 μL DMSO，置搖床上低速振蕩10 min，使結(jié)晶物充分溶解，然后置于酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀上檢測(cè)，波長(zhǎng)為490 nm，記錄光密度A值?？瞻讓?duì)照組做相同處理。

1.3.5 ALP活性檢測(cè) 獲取細(xì)胞及接種方法同上，根據(jù)ALP試劑盒的說(shuō)明，分別加入試劑1、2液50 μL離心5 min后加入試劑3液50 μL，置于酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀上檢測(cè)，選擇520 nm波長(zhǎng)，記錄吸光度A值?？瞻讓?duì)照組做相同處理。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 16.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，同一時(shí)間組內(nèi)比較采用單因素方差分析，不同時(shí)間組間兩兩比較使用秩和檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)為雙側(cè)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 17-β雌二醇處理組

不同濃度17-β雌二醇作用不同時(shí)間后，經(jīng)MTT檢測(cè)得到的A值見(jiàn)表1。從表1可見(jiàn)：同一處理時(shí)間，C組（10-8 mol·L-1組）多優(yōu)于其他實(shí)驗(yàn)組，實(shí)驗(yàn)組多優(yōu)于E組（對(duì)照組）；各處理時(shí)間組的表現(xiàn)趨勢(shì)相同，均隨著17-β雌二醇濃度的增高，成骨細(xì)胞活性增強(qiáng)，達(dá)到高峰后逐漸回落。各時(shí)間組的增長(zhǎng)百分比結(jié)果見(jiàn)圖1，可見(jiàn)各時(shí)間段的曲線趨勢(shì)大致相同，隨著17-β雌二醇濃度的升高，曲線升高，達(dá)到峰值后開(kāi)始回落，其中5、7 d組中D組（10-7 mol·L-1組）呈現(xiàn)明顯負(fù)增長(zhǎng)，5 d組中C組（10-8 mol·L-1組）明顯高于其他各組。

ALP結(jié)果的分析趨勢(shì)與MTT相同，表現(xiàn)為C3組成骨細(xì)胞分化活性最佳。

2.2 FSS處理組

2.2.1 細(xì)胞形態(tài)觀察 倒置相差顯微鏡下觀察可見(jiàn)：FSS作用前細(xì)胞呈多角形、梭形，排列無(wú)序（圖2左）；

FSS作用后細(xì)胞呈長(zhǎng)梭形，細(xì)胞長(zhǎng)軸沿力的方向排列（圖2右）。

2.2.2 MTT檢測(cè)結(jié)果 不同力值的FSS作用不同時(shí)間后，MTT檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)表2：每個(gè)作用時(shí)間組內(nèi)，隨著力值增大，A值呈上升趨勢(shì)，到達(dá)高峰后，隨著力值繼續(xù)增大，A值則呈下降趨勢(shì)；在3組數(shù)據(jù)中，作用60 min組明顯高于其他組。經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)檢驗(yàn)，1組（作用15 min組）內(nèi)各實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意

義（P>0.05）；2組（作用60 min組）內(nèi)，c2組（12×10-5 N）優(yōu)于其他各組，e2組（25×10-5 N）低于對(duì)照組（P<0.05）；3組（作用120 min組）的趨勢(shì)與2組相同。

2.2.3 ALP檢測(cè)結(jié)果 ALP檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)表3。經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，ALP的變化趨勢(shì)與MTT結(jié)果基本相同，c2組（12×10-5 N作用60 min）成骨細(xì)胞的增殖活性最佳。

2.3 FSS+17-β雌二醇雙因素處理組

將篩選出的最佳濃度（10-8 mol·L-1）17-β雌二醇和最佳FSS力值（12×10-5 N）用作雙因素處理，不同處理組的MTT和ALP檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)表4。MTT數(shù)據(jù)分析結(jié)果顯示：Ⅰ組大于其他3組（P<0.05），Ⅱ、Ⅲ組之間無(wú)明顯差異（P>0.05），但均大于對(duì)照組（P<0.05）。ALP數(shù)據(jù)分析結(jié)果與MTT的變化趨勢(shì)基本相同，Ⅰ組的ALP活性最強(qiáng)，且優(yōu)于Ⅱ、Ⅲ組。

3 討論

隨著我國(guó)國(guó)民結(jié)構(gòu)的老齡化，骨質(zhì)疏松患病率的增高、骨折危險(xiǎn)性的增加及牙齒缺失后牙槽骨的吸收都成為現(xiàn)代醫(yī)學(xué)亟需解決的問(wèn)題。如何維持骨改建的平衡，促進(jìn)骨的生長(zhǎng)和重建，抑制或減緩骨吸收成為近年研究的熱點(diǎn)。影響骨改建的因素很多，

雌激素和FSS刺激是其中2個(gè)重要的因素[2]，目前關(guān)

于這2種因素影響骨改建的研究也是一大熱點(diǎn)。

雌激素是由卵巢分泌的一種性激素，能夠維持機(jī)體的生理功能，可用來(lái)治療由于雌激素缺乏所導(dǎo)致的各種疾病。這種替代療法已得到普遍應(yīng)用。雌二醇可以通過(guò)雌激素受體抑制成骨細(xì)胞凋亡，促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖，提高ALP活性，促使骨基質(zhì)礦化。有研究[7]發(fā)現(xiàn)：成骨細(xì)胞是雌二醇的直接靶器官。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：成骨細(xì)胞的活性并不始終與17-β雌二醇的濃度呈正相關(guān)關(guān)系，在17-β雌二醇濃度為10-8 mol·L-1作用5 d時(shí)，細(xì)胞的增殖活性最佳，而隨著濃度的繼續(xù)升高，增殖活性開(kāi)始降低。

機(jī)械應(yīng)力是影響骨改建的另一個(gè)重要因素，適當(dāng)?shù)臋C(jī)械應(yīng)力刺激能夠促進(jìn)骨組織的生長(zhǎng)。在骨改建過(guò)程中，成骨細(xì)胞的增殖和分化有重要的作用。吳丹等[8]研究證實(shí)：FSS作用于成骨細(xì)胞后，其增殖能力提高，細(xì)胞活性增強(qiáng)。本研究結(jié)果表明：對(duì)體外培養(yǎng)的MC3T3-E1細(xì)胞施加FSS，力值為12×10-5 N作用60 min時(shí)，其促增殖效果最明顯；加力后可見(jiàn)細(xì)胞長(zhǎng)軸沿力的方向排列。FSS施加力值和時(shí)間長(zhǎng)短不同，成骨細(xì)胞的反應(yīng)也不同。隨著力加載時(shí)間的延長(zhǎng)，成骨細(xì)胞對(duì)應(yīng)力的敏感性減弱，這可能與其逐步適應(yīng)了應(yīng)力刺激有關(guān)。當(dāng)力值較大時(shí)，細(xì)胞活性反而降低，提示過(guò)大的應(yīng)力非但不能促進(jìn)成骨細(xì)胞的增殖反而會(huì)抑制其生長(zhǎng)活性。在有關(guān)成骨細(xì)胞的體外研究中，應(yīng)注意FSS強(qiáng)度的取值范圍。

Genetos等[9]研究證實(shí)：骨小管內(nèi)液體的流動(dòng)對(duì)

成骨細(xì)胞的作用主要由剪應(yīng)力介導(dǎo)。FSS加載裝置有很多種，平行板流室加載系統(tǒng)有其獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)，在平行板流動(dòng)小室里，能夠達(dá)到層流和二維流動(dòng)，通過(guò)調(diào)節(jié)蠕動(dòng)泵來(lái)提供穩(wěn)定有效的FSS，而且設(shè)備輕便，培養(yǎng)基更換方便，易于培養(yǎng)，易于鏡下觀察，加力所需培養(yǎng)基的量也較少。本實(shí)驗(yàn)所采用的四川大學(xué)獲取專利的FSS加載裝置能夠精確地控制力值的大小[10]，較好地模擬了體內(nèi)骨組織的成骨細(xì)胞受到的應(yīng)力狀態(tài)，其施加的FSS大小均一，并且可以調(diào)節(jié)到很小的范圍，得到的實(shí)驗(yàn)結(jié)果具有代表性。

成骨細(xì)胞受到10-8 mol·L-1的17-β雌二醇和12×10-5 N的力影響時(shí)，細(xì)胞增殖活性明顯高于單純施加10-8 mol·L-1的17-β雌二醇和單純施加12×10-5 N的加力組，提示17-β雌二醇和FSS對(duì)成骨細(xì)胞具有協(xié)同作用。這可能與二者提高了成骨細(xì)胞對(duì)彼此的敏感性有關(guān)，亦有可能與二者共同促進(jìn)某一離子通道的開(kāi)放或者激活某一信號(hào)通路有關(guān)。

綜上所述，由本實(shí)驗(yàn)可以得出以下結(jié)論：濃度為10-8 mol·L-1的17-β雌二醇作用5 d時(shí)，成骨細(xì)胞的增殖活性優(yōu)于其他17-β雌二醇處理組；FSS力值為12×10-5 N作用60 min時(shí)，成骨細(xì)胞的增殖活性大于其他FSS處理組；當(dāng)二者同時(shí)作用于成骨細(xì)胞時(shí)，其增殖活性大于任一單因素處理組，此雙因素具有協(xié)同作用。本實(shí)驗(yàn)為探討體外培養(yǎng)成骨細(xì)胞的骨代謝相關(guān)信號(hào)傳導(dǎo)通路提供了一定的參考。

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（本文編輯 吳愛(ài)華）