不同條件對(duì)胰蛋白酶水解酪蛋白水解度的影響

于傳瑞,杜開(kāi)書(shū),吳菲,申文鵬,婁偉強(qiáng),丁凱,李淑梅

（河南科技學(xué)院,河南新鄉(xiāng)453003）

酪蛋白是牛乳中主要的蛋白質(zhì),約占牛乳蛋白質(zhì)總量的80%～82%,是一種全價(jià)蛋白質(zhì),酪蛋白能夠?yàn)樯矬w提供必需氨基酸,但酪蛋白堅(jiān)硬、致密,極難補(bǔ)充消化吸收[1-2].為此,人們通過(guò)對(duì)酪蛋白進(jìn)行水解獲得多肽類(lèi)物質(zhì),這些多肽類(lèi)物質(zhì)不僅具有營(yíng)養(yǎng)價(jià)值,而且使其吸收利用率大為增加,更重要的是使其具有原蛋白質(zhì)或其組成氨基酸所沒(méi)有的功能.目前,在酪蛋白水解物中發(fā)現(xiàn)許多多肽類(lèi)物質(zhì),如抗菌肽、免疫活性肽、促進(jìn)礦物離子吸收肽等.因此,確定蛋白質(zhì)合適的水解條件尤為必要[3-6].但是目前水解存在的問(wèn)題是：為了追求高水解度,蛋白酶大劑量使用導(dǎo)致成本增加,酶浪費(fèi)嚴(yán)重.本試驗(yàn)在酶劑量和pH不變的前提下,研究了不同溫度、不同作用時(shí)間對(duì)酪蛋白水解度的影響,再通過(guò)加入SDS來(lái)提高水解度,目前尚無(wú)類(lèi)似報(bào)道.

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

酪蛋白的制備：取1 kg的鮮牛乳,脫脂后醋酸－醋酸鈉緩沖液調(diào)至pH 4.6,使酪蛋白沉淀,4 000 r/min離心15 min后,收集沉淀,再用水洗滌酪蛋白沉淀,再次離心去掉上清液,將沉淀冷凍干燥,即得酪蛋白[7].

1.2 化學(xué)試劑

胰蛋白酶（Trypsin,上海紫一試劑廠生產(chǎn),活力單位 1∶250）,20 mmol/L磷酸鹽緩沖液（pH 7.9）,0.5 mol/L的NaOH等,其他試劑均為分析純.

1.3 酪蛋白的水解

準(zhǔn)確稱取1.000 0 g的酪蛋白,用25 mL 20 mmol/L磷酸鹽緩沖液（pH 7.90）溶解,調(diào)節(jié)其pH至7.0,加入10 mg胰蛋白酶,置于一定溫度的水浴鍋中進(jìn)行水解,加入不同劑量的SDS混勻,經(jīng)過(guò)一定反應(yīng)時(shí)間后,將反應(yīng)體系置于100℃水浴鍋中煮沸5 min,使胰蛋白酶失活,反應(yīng)終止[8-9].

1.4 水解度的測(cè)定

水解開(kāi)始時(shí),調(diào)節(jié)反應(yīng)體系的pH為7.0,反應(yīng)結(jié)束后,先測(cè)定反應(yīng)體系的pH值,再用0.5 mol/L的NaOH將反應(yīng)體系的pH調(diào)到原來(lái)的pH值7.0,記錄下所用的堿液的量,按下式即可計(jì)算出酪蛋白的水解度：水解度 DH/%=B（Mb）（1/α）（1/MP）（1/htot）×100.其中：B為消耗的 NaOH 的體積 /mL,Mb 為 NaOH的濃度/（mol/L）,α為氨基酸的解離度；在pH 7.0,50℃的試驗(yàn)條件下,對(duì)于酪蛋白,1/α為2.26；MP為蛋白質(zhì)的質(zhì)量/g,htot為每g原料蛋白質(zhì)中肽鍵的毫摩爾數(shù),對(duì)于酪蛋白,該值取8.2[10-11].

2 結(jié)果與分析

2.1 溫度對(duì)酪蛋白水解度的影響

在pH 7.0,底物濃度為4%,酶添加量為2 500 U/g時(shí),分別在30、40、50、60和70℃溫度下反應(yīng)60 min,得到溫度對(duì)酪蛋白水解度的影響,結(jié)果見(jiàn)圖1.

圖1 溫度對(duì)酪蛋白水解度的影響Fig.1 Influence of temperature on hydrolysis ofcasein

由圖1可知,溫度為30℃時(shí),酪蛋白水解度僅為2.87%,隨著反應(yīng)體系溫度的升高,酪蛋白水解度逐漸增大,50℃時(shí),水解度趨于最大值,其水解度為6.92%.當(dāng)溫度高于60℃時(shí),隨著溫度的升高,胰蛋白酶逐漸變性失活,酪蛋白的水解度反而呈現(xiàn)下降趨勢(shì).因此,試驗(yàn)選取50℃為最佳水解溫度.

2.2 作用時(shí)間對(duì)酪蛋白水解度的影響

在pH 7.0,底物濃度為4%,酶的添加量為2 500 U/g,反應(yīng)體系溫度為50℃條件下,測(cè)定不同水解時(shí)間對(duì)酪蛋白水解度的影響,結(jié)果見(jiàn)圖2.

圖2 作用時(shí)間對(duì)酪蛋白水解度的影響Fig.2 Influence of time on hydrolysis ofcasein

由圖2可知,酪蛋白的水解度隨酶解時(shí)間的延長(zhǎng)而增大.當(dāng)反應(yīng)時(shí)間在40～80 min時(shí),水解度增長(zhǎng)較快；當(dāng)水解時(shí)間超過(guò)80 min后,水解度隨時(shí)間的增加而增大,但其增幅趨于平緩.考慮到時(shí)效性,試驗(yàn)選取80 min為最佳水解時(shí)間.

2.3 SDS對(duì)酪蛋白水解度的影響

在pH 7.0,底物濃度為4%,酶的添加量為2 500 U/g,反應(yīng)溫度為50℃,反應(yīng)時(shí)間為80 min條件下,測(cè)定不同劑量的SDS對(duì)酪蛋白水解度的影響,結(jié)果見(jiàn)圖3.

圖3 SDS對(duì)酪蛋白水解度的影響Fig.3 Influence ofSDSon hydrolysis ofcasein

由圖3可知,隨著SDS濃度的增加,酪蛋白水解度逐漸增大,當(dāng)反應(yīng)體系中SDS 的質(zhì)量濃度為0.001 28 g/mL時(shí),酪蛋白的水解度達(dá)到最大值13.5%.因此,試驗(yàn)選取0.001 28 g/mL為SDS最佳加入濃度.

3 結(jié)論

通過(guò)單因素試驗(yàn)得出在底物濃度為4%、加酶量2 500 U/g、pH為7.0的條件下,選擇溫度為50℃,水解時(shí)間為80 min,胰蛋白酶對(duì)酪蛋白的水解效果較佳,水解度為7.30%；同等條件下向此體系加入SDS,使SDS在體系中的終濃度為0.001 28 g/mL,水解度提高為13.50%,可見(jiàn)SDS對(duì)胰蛋白酶水解酪蛋白有明顯促進(jìn)作用.

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