里氏木霉發(fā)酵法制備纖維素酶粗酶液及其酶促打漿的應(yīng)用

張正健，韓雨彤，陳蘊(yùn)智，胡惠仁

(1. 天津科技大學(xué)包裝與印刷工程學(xué)院，天津 300222；2. 天津市制漿造紙重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津科技大學(xué)材料科學(xué)與化學(xué)工程學(xué)院，天津 300457)

1 材料與方法

1.1 原料與儀器

里氏木霉(Trichoderma reesei)DWC11，天津科技大學(xué)微生物實(shí)驗(yàn)室提供；思茅松 BKP，云南云景林紙股份有限公司提供．羧甲基纖維素鈉(CMC)、無(wú)水葡萄糖、乙酸鈉、硫酸鎂、冰醋酸、硫酸錳、鹽酸、磷酸二氫鉀、硝酸鈉、磷酸氫二鉀、碳酸氫鈉、3，5-二硝基水楊酸(DNS)、氫氧化鈉、硫酸、亞硫酸氫鈉、苯酚、氯化鈷、氯化鈣、氯化鋅、氯化鉀、硫酸亞鐵、酒石酸鉀鈉、牛肉膏、蛋白胨、酵母粉、硫酸銨、硝酸銨、尿素、微晶纖維素、蔗糖、麥芽糖、麩皮、麥稈粉、檸檬酸鈉、檸檬酸、水楊素，市售．

恒溫培養(yǎng)箱，江蘇正基儀器有限公司；恒溫培養(yǎng)振蕩器，上海智城分析儀器制造有限公司；高速冷凍離心機(jī)，日本日立公司；高壓滅菌鍋，上海申安醫(yī)療器械廠；紫外分光光度計(jì)，LabTech公司；Valley打漿機(jī)，陜西科技大學(xué)機(jī)械廠；真空泵，鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司；PFI磨，挪威制漿造紙研究院；肖伯氏打漿度儀，宜賓造紙廠；快速紙頁(yè)成形器，EStanit Gbmh公司；抗張強(qiáng)度測(cè)試儀、撕裂度測(cè)試儀、耐破度測(cè)試儀，Lorentzen & Wettre公司．

1.2 培養(yǎng)基和相關(guān)溶液的配制

1.2.1 培養(yǎng)基

里氏木霉試管斜面培養(yǎng)基：1,g CMC、4,g營(yíng)養(yǎng)元素液、0.1,g微量元素液、2,g瓊脂，加入蒸餾水至總質(zhì)量為 100,g，pH 6.0．里氏木霉種子發(fā)酵培養(yǎng)基：1,g葡萄糖、4,g營(yíng)養(yǎng)元素液、1,g麩皮、0.1,g微量元素液，加入蒸餾水至總質(zhì)量為100,g，pH 5.5～6.0．里氏木霉基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基：1,g麩皮、4,g營(yíng)養(yǎng)元素液、0.2,g微量元素液、1,g碳源，加入蒸餾水至總質(zhì)量為100,g．

1.2.2 相關(guān)溶液的配制

營(yíng)養(yǎng)元素液：6.25,g檸檬酸鈉、12.5,g磷酸二氫鉀、5,g硫酸銨、1,g硫酸鎂和 0.5,g氯化鈣溶解后定容至100,mL．微量元素液：2.5,g硫酸亞鐵、0.98,g硫酸錳、0.83,g氯化鋅、1,g氯化鈷和 5,mL 2,mol/L HCl溶解后定容至100,mL．

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

在溫度 30,℃、搖床轉(zhuǎn)速 120,r/min條件下培養(yǎng)96,h，通過(guò)改變氮源和碳源種類、碳源加入量、麩皮加入量、微量元素液加入量和營(yíng)養(yǎng)元素液加入量，以發(fā)酵粗酶液的吸光度為評(píng)價(jià)依據(jù)，系統(tǒng)考察上述各種條件變化對(duì)纖維素酶各組分酶活的影響．在考察加入量對(duì)產(chǎn)酶的影響時(shí)，其加入量是相對(duì)于培養(yǎng)基總量(含自身)的質(zhì)量百分比．在一定溫度和 pH 條件下，1,mL酶液(1,g酶粉)每分鐘水解相應(yīng)底物產(chǎn)生 1,μg還原糖(以葡萄糖計(jì))的酶量定義為 1個(gè)酶活單位．濾紙酶活(FPA)表示酶的總體活性、Cx酶活表示內(nèi)切葡萄糖苷酶活性、C1酶活表示外切葡萄糖苷酶活性、Cb酶活表示 β-葡萄糖苷酶活性，對(duì)應(yīng)的降解底物分別為 1,cm×6,cm 的濾紙、1% CMC溶液、50,mg脫脂棉球和 1%水楊素溶液．取一定量稀釋酶液，與相應(yīng)底物反應(yīng)一定時(shí)間，反應(yīng)液經(jīng) DNS顯色，測(cè)定530,nm的吸光度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線(以葡萄糖為標(biāo)準(zhǔn)物)確定還原糖產(chǎn)生的量，從而確定出酶的活力，吸光度越大，表明酶活性越強(qiáng)．通過(guò)改變酶用量，考察其對(duì)打漿性能和紙漿物理性能的影響，具體方法見(jiàn)參考文獻(xiàn)[7]．

2 結(jié)果與討論

2.1 里氏木霉發(fā)酵培養(yǎng)條件對(duì)產(chǎn)酶的影響

2.1.1 氮源和碳源種類

1995年，建設(shè)部印發(fā)了《城市園林綠化企業(yè)資質(zhì)管理辦法》和《城市園林綠化企業(yè)資質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)》，將園林綠化企業(yè)自此從建工企業(yè)中分離。2007年，建設(shè)部印發(fā)了《工程設(shè)計(jì)資質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)》，又將風(fēng)景園林工程從市政公用行業(yè)脫離出來(lái)。2011年3月，風(fēng)景園林學(xué)被批準(zhǔn)為國(guó)家一級(jí)學(xué)科，與城鄉(xiāng)規(guī)劃學(xué)、建筑學(xué)形成三足鼎立之勢(shì)，風(fēng)景園林行業(yè)的地位產(chǎn)生了巨大提升。但目前的城鄉(xiāng)園林綠化法規(guī)大多仍然設(shè)置在城市市政公用事業(yè)規(guī)體系之下，在生態(tài)文明建設(shè)日益重要的今天，缺乏一定的獨(dú)立性。

氮源和碳源種類對(duì)產(chǎn)酶的影響如圖 1所示．由圖 1(a)可以看出，氮源不同對(duì)各組分酶活有顯著影響，無(wú)機(jī)氮源以硫酸銨為最佳，有機(jī)氮源以牛肉膏為最佳．產(chǎn)酶高低依次是硫酸銨＞牛肉膏＞硝酸銨＞蛋白胨＞酵母膏＞尿素．以尿素為氮源，酶活很低，這是由于尿素使液體培養(yǎng)基的pH增加所致．硫酸銨所對(duì)應(yīng)的各組分酶活都較高，并且價(jià)格較低，原料易得，故采用硫酸銨為培養(yǎng)基的氮源．

從圖 1(b)中可以看出，固體碳源的產(chǎn)酶效果要比可溶性碳源好，這是因?yàn)槔w維素酶是誘導(dǎo)酶，受碳源種類的影響較大，纖維材料能夠產(chǎn)生更好的誘導(dǎo)效果．當(dāng)采用思茅松 BKP和微晶纖維素為碳源時(shí)，各組分酶活都比以麥稈和堿處理麥稈為碳源時(shí)要高，這是因?yàn)辂湺捄蛪A處理麥稈的木素和半纖維素含量高，阻礙了里氏木霉菌體與纖維的接觸，因此其產(chǎn)纖維素酶活性較低．由于本發(fā)酵所制纖維素酶最終目的是用于思茅松 BKP的酶促打漿研究，所以為了能夠獲得針對(duì)性更強(qiáng)的纖維素酶，本研究采用思茅松 BKP為發(fā)酵碳源．

圖1 不同氮源和碳源對(duì)產(chǎn)酶的影響Fig.1 Effect of different nitrogen and carbon sources on cellulase production

2.1.2 碳源加入量

碳源加入量對(duì)產(chǎn)酶影響較大，如果加入量過(guò)低，則不能夠提供菌體生長(zhǎng)所需要的碳源量；如果加入量過(guò)高，會(huì)導(dǎo)致發(fā)酵液的固含量過(guò)高，不易搖動(dòng)起來(lái)，從而導(dǎo)致溶氧量不足，菌體無(wú)法正常生長(zhǎng)，最終使得產(chǎn)酶活性較低．碳源加入量對(duì)產(chǎn)酶的影響如圖 2所示．

圖2 碳源加入量對(duì)產(chǎn)酶的影響Fig.2 Effect of carbon source dosage on cellulase production

從圖 2中可以看出，當(dāng)思茅松 BKP加入量為0.5%～1%時(shí)，F(xiàn)PA 和 C1酶活相對(duì)較高，當(dāng)思茅松BKP加入量大于1%時(shí)，F(xiàn)PA和C1酶活明顯降低；當(dāng)思茅松BKP加入量為0.5%～3%時(shí)，Cb和Cx酶活相對(duì)較高，當(dāng)思茅松 BKP加入量大于 3%時(shí)，Cb和 Cx酶活迅速降低．這表明 FPA和 C1酶活受思茅松BKP加入量的影響較大，而Cb和Cx酶活受其影響較小．當(dāng)思茅松 BKP加入量為 1%時(shí)，各組分酶活都達(dá)到最大值，因此本研究采用的思茅松 BKP加入量為1%．

2.1.3 麩皮加入量

麩皮加入量對(duì)產(chǎn)酶的影響如圖 3所示．可以看出，當(dāng)麩皮添加量為 1%時(shí)，各組分酶活均達(dá)到最大值，隨著其加入量的繼續(xù)增加，活力反而逐漸下降，這說(shuō)明麩皮添加量過(guò)大對(duì)發(fā)酵不利，因此在發(fā)酵過(guò)程中添加1%的麩皮來(lái)提高發(fā)酵產(chǎn)酶活力．

圖3 麩皮加入量對(duì)產(chǎn)酶的影響Fig.3 Effect of bran dosage on cellulase production

2.1.4 微量元素液加入量

微量元素液含有 Fe2+、Mn2+、Zn2+和 Co2+，這些金屬離子在一定的濃度下對(duì)纖維素酶的合成以及酶活性有促進(jìn)作用，比如Fe2+離子在酶與底物之間起著連橋作用，從而更有利于底物與酶的活性中心必需基團(tuán)的結(jié)合．但是，如果上述離子濃度過(guò)大，則對(duì)產(chǎn)酶有抑制作用．微量元素液加入量對(duì)產(chǎn)酶的影響如圖 4所示．

圖4 微量元素液加入量對(duì)產(chǎn)酶的影響Fig.4 Effect of microelement liquid dosage on cellulase production

從圖中可以看出，當(dāng)微量元素液用量為 0.2%時(shí)，各組分酶活都達(dá)到最大，大于或小于 0.2%都對(duì)產(chǎn)酶不利，因此確定發(fā)酵培養(yǎng)基中的微量元素液加入量為0.2%．

2.1.5 營(yíng)養(yǎng)元素液加入量

營(yíng)養(yǎng)元素液中包含發(fā)酵所必需的氮源(硫酸銨)、磷酸氫二鉀-檸檬酸鈉緩沖溶液、Mg2+和 Ca2+．由于微生物在代謝過(guò)程中不斷地向培養(yǎng)基中分泌代謝產(chǎn)物，影響培養(yǎng)基的pH變化，對(duì)大多數(shù)微生物來(lái)說(shuō)，主要產(chǎn)生酸性產(chǎn)物，所以在培養(yǎng)過(guò)程中常引起 pH的下降，影響微生物的生長(zhǎng)繁殖速度．為了盡可能地減緩培養(yǎng)過(guò)程中 pH的變化，在配制培養(yǎng)基時(shí)，加入一定的緩沖物質(zhì)可以起到調(diào)節(jié)pH的作用．營(yíng)養(yǎng)元素液中的鉀、鈣和鎂離子還參與細(xì)胞結(jié)構(gòu)物質(zhì)的組成，并有能量轉(zhuǎn)移、細(xì)胞透性調(diào)節(jié)等功能．營(yíng)養(yǎng)元素液用量對(duì)產(chǎn)酶的影響如圖5所示．

圖5 營(yíng)養(yǎng)元素液用量對(duì)產(chǎn)酶的影響Fig.5 Effect of nutrition element liquid dosage on cellulase production

由圖 5可知，隨著營(yíng)養(yǎng)元素液用量的增加，纖維素酶各組分酶活先上升后下降，在用量為 8%時(shí)均達(dá)到最高值．當(dāng)用量小于 8%時(shí)，不能滿足菌體的生長(zhǎng)所需，但是用量過(guò)大時(shí)則對(duì)產(chǎn)酶有抑制作用．因此確定發(fā)酵培養(yǎng)基中的營(yíng)養(yǎng)元素液加入量為8%．

2.2 酶促打漿

在氮源(硫酸銨)0.2%、碳源(思茅松 BKP)1%、麩皮 1%、微量元素液 0.2%、營(yíng)養(yǎng)元素液 8%，溫度30,℃、搖床轉(zhuǎn)速 120,r/min條件下發(fā)酵培養(yǎng) 96,h，其各組分酶活為：FPA 酶活 471.42,U/mL，Cx酶活3,083.19,U/mL，C1酶活 471.42,U/mL，Cb酶活為27.79,U/mL．通過(guò)改變酶用量，研究其在酶促打漿中的作用．

酶用量(按 FPA 酶活計(jì)算，下同)對(duì)紙漿打漿度和物理性能的影響見(jiàn)表 1．從中可以看出，在打漿時(shí)間均為 4,min的條件下，當(dāng)酶用量在 0～5,U/g之間時(shí)，打漿度增加較平緩；酶用量大于5,U/g時(shí)，打漿度明顯上升，酶用量為 7,U/g時(shí)，打漿度比空白樣高出10,°SR．打漿度的增加是由酶解作用造成的．酶解作用使紙漿纖維細(xì)胞壁的結(jié)構(gòu)受到破壞，使纖維產(chǎn)生內(nèi)部和外部細(xì)纖維化，從而使其易于打漿．在相同打漿時(shí)間內(nèi)，酶處理后的漿樣比空白樣的打漿度要高，酶用量越大提高程度越大，即在達(dá)到相同打漿度的情況下，酶處理后的漿樣能有效降低打漿時(shí)間，酶用量越大所需的打漿時(shí)間就越少，從而降低打漿能耗．

表1 酶用量對(duì)打漿和紙漿物理性能的影響Tab.1 Effect of cellulase dosage on beating degree and the pulp physical properties

在研究酶用量對(duì)紙漿物理性能的影響時(shí)，空白樣和酶處理樣都需達(dá)到同一打漿度，即控制在48,°SR．紙漿的物理性能的變化是纖維間結(jié)合力、纖維內(nèi)在強(qiáng)度和纖維平均長(zhǎng)度綜合影響的結(jié)果．從表 1中可以看出，抗張指數(shù)只在酶用量為 5,U/g時(shí)略有增加；耐破指數(shù)和撕裂指數(shù)隨著酶用量增加都呈逐漸下降趨勢(shì)，但下降的幅度都不大．因此，采用里氏木霉自制纖維素酶進(jìn)行酶促打漿，不僅能夠有效地提高打漿性能，而且還能夠最大程度地保持紙漿的強(qiáng)度性能，這對(duì)降低酶促打漿生產(chǎn)成本、推廣其工業(yè)化應(yīng)用具有一定實(shí)用價(jià)值．

3 結(jié) 論

里氏木霉發(fā)酵制備纖維素酶粗酶液的發(fā)酵培養(yǎng)條件如下：氮源(硫酸銨)0.2%、碳源(思茅松BKP)1%、麩皮 1%、微量元素液 0.2%、營(yíng)養(yǎng)元素液8%，溫度 30,℃、搖床轉(zhuǎn)速 120,r/min，培養(yǎng) 96,h．隨著里氏木霉所制纖維素酶用量的增加，打漿度逐漸上升，思茅松 BKP的打漿性能得到明顯提高；紙漿的物理強(qiáng)度性能有所下降，但下降幅度不大．

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