糖基化終末產物調節(jié)氧化應激影響臍血間充質干細胞增殖及普羅布考保護作用

王 哲，王秋實*，劉曉玉，張殿寶

糖基化終產物(Advanced glycosylation end products，AGEs)是指蛋白質、脂質或核酸等大分子在沒有酶參與的條件下自發(fā)地與葡萄糖或其他還原單糖反應所生成的穩(wěn)定的共價物［1］。大量研究表明，糖尿病動物和患者血中AGEs含量明顯升高，并伴有間充質干細胞功能的損害［2］。臍血間充質干細胞(Mesenchymal stem cells，MSCs)作為一種更原始的MSC群，由于其無倫理問題，且來源廣泛，易采集、易擴增等，目前已成為糖尿病患者細胞移植和基因治療的有效載體［3］。研究表明，移植臍血MSCs治療效果與MSCs的增殖能力相關，然而，細胞治療過程中，AGEs對臍血MSCs增殖的影響還不清楚?？寡趸瘎┛梢愿纳铺悄虿』颊哐趸瘧ぶ笜?，提示可以將抗氧化劑用于MSCs移植。普羅布考(Probucol)作為一種抗氧化劑，由于其具有保護血管內皮細胞作用，目前已成為糖尿病患者的常用藥物。本實驗采用含糖基化修飾的牛血清白蛋白(Advanced glycation end products－bovine serum albumin，AGE－BSA)的培養(yǎng)基對臍血MSCs培養(yǎng)，并應用抗氧化劑普羅布考進行干預，探討AGEs對臍血MSCs增殖的影響及普羅布考作用機制，為臨床提高干細胞移植治療糖尿病后供體干細胞的增殖能力提供新的依據。

1 材料和方法

1.1 主要試劑和儀器 普羅布考原料藥(山東齊魯藥業(yè)有限公司)，我院臍血庫在無菌條件下取健康足月剖宮產新生兒臍血(經醫(yī)院倫理委員會許可和產婦同意)100 mL，淋巴細胞分離液(天津灝洋生物制品有限公司)，胎牛血清(美國Gibco公司)，熒光標記的抗 CD34、CD45、CD105 抗體(美國Biolegend公司)，小牛血清白蛋白和葡萄糖(美國Sigma公司)，甲基纖維素(美國Amresco 0458公司)，人間充質干細胞培養(yǎng)基(美國Stem Cell Technology公司)，胰蛋白酶(美國 Gibco公司)，WST細胞生長檢測試劑盒(日本株氏會社同仁化學研究所)，二氯醋酸熒光素(美國Sigma公司)，SOD和GSH－Px檢測試劑盒(南京建成生物工程研究所)。

1.2 糖基化修飾的牛血清白蛋白的制備與檢測

將小牛血清白蛋白50 g/L與0.5 mmol/L葡萄糖溶于磷酸鹽緩沖液中，室溫放置過夜，對照組中不含葡萄糖，其余條件一致。過濾除菌后置37℃避光孵育3個月。實驗前置于透析膜中，去除未結合的葡萄糖。熒光光譜掃描檢測糖基化修飾的牛血清白蛋白(AGE－BSA)。

1.3 臍血間充質干細胞分離與鑒定 采集后的臍血加入等體積PBS稀釋，采用5%甲基纖維素結合Ficoll分離獲取單個核細胞。無菌條件下將細胞接種于25 cm2培養(yǎng)皿進行原代培養(yǎng)。每3 d換液1次，待細胞沿皿底生長面積達80% ～90%，進行傳代。取第3代臍血MSCs，應用熒光標記的抗CD34、CD45、CD105抗體，進行流式細胞儀檢測。1.4 實驗分組 實驗取消化后第3代貼壁培養(yǎng)的臍血MSCs分為BSA對照組、AGE－BSA作用組、普羅布考干預組(10、20、50、100 μmol/L)，分別于12、24和36 h時間點進行操作。

1.5 臍血MSCs及取標本 以106個/mL濃度接種于24孔板，細胞培養(yǎng)24 h后，換無血清培養(yǎng)液靜止12 h，然后向普羅布考組加入普羅布考，使其終濃度分別為 10、20、50、100 μmol/L，30 min 后，分別向普羅布考組和AGE－BSA組加入AGE－BSA 100 mg/L，到各時間點后取細胞進行檢測。

1.6 臍血間充質干細胞增殖的測定(WST法)實驗終止前2 h，每孔加入 CKK－8 試劑20 μL，培養(yǎng)結束時以酶標儀檢測吸光度(A450值)。

1.7 臍血間充質干細胞活性氧生成的測定 收集各組細胞并重懸于300 μL Bindding Buffer中，加入10 U二氯醋酸熒光素(2HDCF－DA)輕輕混勻，室溫避光情況下反應30 min，流式細胞儀測定熒光強度，即為臍血MSCs內活性氧(Reactive oxygen species，ROS)的含量。

1.8 臍血間充質干細胞谷胱甘肽過氧化物酶和超氧化物歧化酶活性的檢測 收集各組細胞，經超聲粉碎后離心取上清進行谷胱甘肽過氧化物酶(Glutathione peroxidase－Px，GSH－Px)和超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase，SOD)檢測，操作步驟按說明書進行。

2 結果

2.1 臍血間充質干細胞形態(tài)及鑒定 原代臍血MSCs培養(yǎng)6 d后，細胞形成分散的集落，呈長梭形，形態(tài)飽滿(圖1a)，第3代臍血MSCs培養(yǎng)4～7 d，細胞融合鋪滿皿底，呈紡錘形、梭型、三角形等多種形態(tài)，輪廓清晰，部分胞漿形成短小突起，胞漿折光性好，胞內顆粒少;細胞經傳代貼壁后，細胞形態(tài)比較一致，呈成纖維狀并逐漸形成細胞集落(圖1b)，該細胞可持續(xù)傳代。第3代臍血MSCs經流式細胞儀檢測結果顯示，CD105表達，而CD34和CD45不表達(圖2)。

圖1 臍血間充質細胞形態(tài)

2.2 普羅布考對AGE－BSA刺激下臍血間充質干 細胞增殖的影響 與BSA對照組比較，AGE－BSA組MSCs細胞增殖明顯受抑制，普羅布考可以改善AGE－BSA刺激的增殖能力，呈時間和濃度依賴關系。普羅布考在20 μmol/L時開始顯示保護作用，隨著作用濃度升高和時間延長，保護作用更加顯著。見表1。

圖2 第3代的臍血間充質干細胞表面標志

表1 普羅布考對AGEs-BSA刺激下臍血MSCs增殖的影響(OD值)

2.3 普羅布考對AGE－BSA刺激下臍血間充質干細胞ROS含量的影響 36 h時間點進行ROS含量檢測的結果顯示，與BSA對照組比較，AGE－BSA組MSCsROS生成顯著升高，而普羅布考在10、20、50、100 μmol/L濃度范圍內預處理30 min可以抑制AGE－BSA誘導的ROS生成增加，并在一定范圍內呈濃度依賴關系。

2.4 普羅布考對AGE－BSA刺激下臍血間充質干細胞GSH－Px和SOD活性的影響 與BSA對照組比較，AGE－BSA組MSCs GSH－Px和SOD活性顯著下降。普羅布考在20、50、100 μmol/L濃度范圍內預處理可以抑制AGE－BSA刺激的GSH－Px和SOD活性下降，呈時間和濃度依賴關系。見表2、表3。

表2 普羅布考對AGE-BSA刺激下臍血間充質干細胞GSH-Px的影響(kU/L)

表3 普羅布考對AGE-BSA刺激下臍血間充質干細胞SOD的影響(kU/L)

3 討論

高齡、動脈粥樣硬化、糖尿病患者的血清AGEs水平顯著升高［4］，體內高濃度的 AGEs對臍血MSCs增殖可能起到了一定的抑制作用。前期實驗發(fā)現，AGEs能促進內皮細胞內ROS生成，減少抗氧化酶生成，增強氧化應激，破壞細胞內環(huán)境穩(wěn)定性，從而影響內皮細胞功能［5］。最近的研究發(fā)現，AGEs對內皮祖細胞數量和功能也有一定影響［6］。有研究報道，AGEs與糖尿病并發(fā)癥的發(fā)生及不良預后相關［7］。然而，AGEs對臍血MSCs數量和功能的影響及可能的機制研究較少。在本研究中，我們以AGE－BSA刺激臍血MSCs后檢測臍血MSCs增殖以及細胞內 ROS濃度，發(fā)現 AGEBSA刺激后可顯著抑制細胞增殖。AGE－BSA刺激后，臍血MSCs內ROS濃度顯著增加。ROS可以作為第二信使觸發(fā)信號轉導調節(jié)細胞功能改變，同時，當ROS的生成速度超過細胞自身抗氧化防御能力即可出現氧化應激。有研究發(fā)現，高血糖能通過調節(jié)細胞內ROS生成和降解的平衡影響干細胞生物學行為［8］。為進一步研究AGEs刺激后細胞抗氧化酶的情況，筆者又檢測了臍血MSCs內SOD和 GSH－Px的活性。結果表明，AGE－BSA能顯著下調臍血MSCs內SOD和GSH－Px的活性。SOD為自由基清除劑，廣泛存在于各種組織中，能清除超氧陰離子自由基，保護細胞免受損傷。GSH－Px是機體內廣泛存在的一種重要催化過氧化氫分解的酶，其特異性催化還原型谷胱甘肽(GSH)對過氧化氫的分解作用。

普羅布考具有調血脂、抗氧化、抗炎、改善內皮細胞功能的作用，其抗氧化作用可能與構效關系有關。普羅布考含14個親脂性甲基，是合成的抗氧化劑，具有極強的親脂性［9］。有研究發(fā)現，抗氧化劑可以改善糖尿病患者氧化應激指標，提示可以將抗氧化劑用于MSCs移植。為了進一步證實普羅布考在AGEs引起的細胞增殖能力降低中的作用，本實驗應用抗氧化劑普羅布考進行干預，檢測結果顯示，與AGEs作用組相比，普羅布考在20、50、100 μmoL 范圍內促進細胞增殖，下調細胞ROS水平，增加 SOD和 GSH－Px的活性(P＜0.05或P＜0.01)。由此推斷，氧化應激在AGEs引起的臍血MSCs細胞增殖能力下降中發(fā)揮重要作用，抗氧化治療可能是提高糖尿病患者供體干細胞增殖功能的有效手段。

本研究初步證實，普羅布考保護AGEs損傷臍血MSCs生物學功能可能是通過調節(jié)氧化應激來實現的。普羅布考一方面通過抑制ROS生成，另一方面通過增加抗氧化酶類的活性，改善機體氧化和抗氧化平衡狀態(tài)，保護細胞功能。深入研究AGEs對臍血MSCs功能與活性的影響和普羅布考保護作用機制，為臨床應用抗AGEs生成和抗氧化等干預方法來提高干細胞移植治療糖尿病后供體干細胞的增殖能力提供新的理論依據。

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