類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者外周血髓源性抑制細胞的檢測及與Th1/Th2 細胞的相關(guān)性分析

許為民，龔愛華，王慧，花盛浩，王旭輝，陳艷，尤海燕，焦志軍

(1.江蘇大學(xué)附屬醫(yī)院檢驗科，江蘇 鎮(zhèn)江212001;2.江蘇大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與醫(yī)學(xué)技術(shù)學(xué)院，江蘇 鎮(zhèn)江212013)

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis，RA)是以關(guān)節(jié)和關(guān)節(jié)周圍組織非感染性炎癥為主的、系統(tǒng)性自身免疫性疾病。RA 的發(fā)病機制仍不清楚，目前認為該病的發(fā)生發(fā)展與CD4+T 細胞(Th 細胞)亞群失衡及功能異常密切相關(guān)［1-2]。髓源性抑制細胞(myeloid-derived suppressor cells，MDSCs)是一群分化成熟受阻而形成的異質(zhì)細胞，可通過分泌誘導(dǎo)性一氧化氮合酶(iNOS)、Ⅰ型精氨酸酶(ARG-1)等抑制T 細胞的增殖和分化［3-4]。此類細胞在RA 外周血中的分布情況尚未見報道。本文擬通過流式細胞術(shù)檢測RA 患者外周血中MDSCs 的比例并分析其與Th1/Th2 細胞的相關(guān)性。

1 對象與方法

1.1 研究對象

選擇2012年4月至7月于江蘇大學(xué)附屬醫(yī)院門診及住院的RA 患者36例，其中，男4例，女32例，年齡30 ～80(51.7 ±12.0)歲。所有病例符合1987年美國風(fēng)濕病學(xué)會診斷標(biāo)準(zhǔn)。根據(jù)腫脹關(guān)節(jié)數(shù)、壓痛關(guān)節(jié)數(shù)、C 反應(yīng)蛋白、紅細胞沉降率等臨床檢測指標(biāo)，計算DAS28 評分，分為2 組:活動組(n =20)和穩(wěn)定組(n =16)。另選江蘇大學(xué)附屬醫(yī)院健康查體人員10例作為對照組，男2例，女8例，年齡32 ～75(52.1 ±15.2)歲，無類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎及其他自身免疫性疾病、感染、腫瘤等。以上標(biāo)本獲取時均取得受試者的知情同意。

1.2 主要試劑和儀器

熒光標(biāo)記的抗體:CD4-PE、IFN-γ-FITC、IL-4-FITC、CD14-PEcy5、HLA-DR-FITC、CD11b-APC、CD33-PE(eBioscience);RPMI-1640、Hanks 液、PBS緩沖液、胎牛血清(Gibco);Ficoll 分離液(Lymphoprep);固定破膜劑(Beckman);流式細胞儀(BD FACS Calibur)。

1.3 標(biāo)本采集

分別抽取RA 患者和健康者外周血3 mL，置于EDTA 抗凝管中。

1.4 MDSCs 膜表面標(biāo)志染色

取100 μL 抗凝全血于流式管中，加入鼠抗人熒光標(biāo)志CD14-PEcy5、HLA-DR-FITC、CD11b-APC、CD33-PE 各5 μL，室溫避光孵育15 min。加入1 mL溶血劑，混勻，室溫避光，反應(yīng)10 min。PBS 洗滌，2000 r/min，離心5 min。棄上清，加入200 μL PBS，混勻，用流式細胞儀進行檢測。

1.5 外周血單個核細胞( peripheral blood mononuclear cell，PBMC) 分離

取抗凝血2 mL，1500 r/min，離心5 min，吸出血漿后，加入等體積PBS 稀釋、混勻，按照1 ∶1 比例，移至Ficoll 分離液中，2000 r/min，離心10 min，用吸管將白膜層移入無菌玻璃管，用PBS 洗滌，1500 r/min，離心5 min，棄去上清液。用RPMI-1640 培養(yǎng)液(含10%胎牛血清)調(diào)整細胞懸液密度為1 ×106/mL。

1.6 膜表面標(biāo)志及胞內(nèi)細胞因子染色

在PBMC 懸液中加入2 μL 佛波醇酯(50 mg/L)和1 μL 離子霉素(100 mg/L)，于37 ℃和5%CO2孵育箱中培養(yǎng)5 h。取出刺激培養(yǎng)的PBMC，用PBS 離心洗滌后加入5 μL CD4-PE，渦旋混勻，室溫避光孵育15 min。經(jīng)洗滌、固定和破膜后將樣品分成2 管，分別加入5 μL IFN-γ-FITC 和5 μL IL-4-FITC，混勻，室溫避光孵育15 min。PBS 洗滌，離心，棄去上清，加入200 μL PBS，混勻，用流式細胞儀進行檢測。

1.7 FCM 檢測分析

以CD4+INF-γ+的表達比例表示Th1 細胞百分比，以CD4+IL-4+的表達比例表示Th2 細胞百分比，以CD14-HLA-DR-CD33+CD11b+的表達比例表示MDSCs 百分比。結(jié)果分析采用Cellquest軟件。

1.8 統(tǒng)計學(xué)分析

實驗數(shù)據(jù)采用GraphPad Prism 5.0 軟件進行分析，多組間均數(shù)比較采用單因素方差分析，進一步兩兩比較采用LSD-t 檢驗。相關(guān)性分析采用Spearman檢驗，以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 RA 患者外周血MDSCs 的比例

以CD14-HLA-DR-CD33+CD11b+作為外周血MDSCs 的表面標(biāo)志，采用流式細胞術(shù)四色標(biāo)志檢測36例RA 患者外周MDSCs 比例，結(jié)果顯示，活動組RA 患者外周血中MDSCs 比例(61.14 ±2.68)%明顯高于穩(wěn)定組(48.29 ±3.96)%和對照組(46.91 ±5.01)%(P 均＜0.05);穩(wěn)定組雖略高于對照組，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)，見圖1。

2.2 RA 患者外周血MDSCs 與Th1、Th2 細胞的相關(guān)性

在檢測MDSCs 的同時，我們檢測了外周血中Th1、Th2 細胞的比例，經(jīng)Spearman 相關(guān)分析，結(jié)果顯示，MDSCs 比例與Th1 細胞比例呈負相關(guān)(r =-0.424，P=0.0219)，而與Th2 細胞比例無明顯相關(guān)性(r=-0.213，P＞0.05)，見圖2。

圖1 類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者外周血中髓源性抑制細胞的檢測結(jié)果Fig 1 Detection of myeloid-derived suppressor cells in peripheral blood from patients with rheumatoid arthritis

圖2 類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者外周血MDSCs 與Th1、Th2細胞的相關(guān)性分析Fig 2 The correlations between myeloid-derived suppressor cells and Th1/Th2 cell in peripheral blood from patients with rheumatoid arthritis

3 討論

MDSCs 是一群具有強免疫抑制功能的異質(zhì)細胞，通過分泌iNOS、ARG-1、活性氧等產(chǎn)物抑制T 細胞增殖活化，促進T 細胞凋亡，減弱機體的免疫監(jiān)視功能，從而成為機體抗腫瘤免疫的最主要障礙。MDSCs在自身免疫性疾病中也發(fā)揮作用，如Zhu 等［5]、Slaney 等［6]通過對實驗性自身免疫性腦脊髓炎(experimental autoimmune encephalomyelitis，EAE)動物模型的研究發(fā)現(xiàn)，MDSCs 能夠發(fā)揮免疫抑制作用，緩解EAE 的癥狀。這一發(fā)現(xiàn)使MDSCs 成為近年來研究自身免疫性疾病的新熱點。

本研究結(jié)果顯示，活動組MDSCs 的比例明顯高于穩(wěn)定組和對照組，而穩(wěn)定組雖然在總體上略高于對照組，但是差異無統(tǒng)計學(xué)意義。結(jié)果表明，RA 患者外周血中MDSCs 的比例增高，尤其在活動期更為明顯。在急慢性炎癥患者和動物模型中(如腫瘤［7-8]、急性移植排斥反應(yīng)［9]以及自身免疫性疾?。?-6，10])，MDSCs 均有顯著增高，這與本文的研究結(jié)果相一致，說明MDSCs 在炎癥狀態(tài)下顯著增多，檢測其比例可作為炎性活動的評估指標(biāo)。

根據(jù)上述結(jié)果，我們推測RA 外周血MDSCs 增多的可能原因如下。在炎癥狀態(tài)下，大量活化的T細胞亞群、異常增多的炎性因子和趨化因子，通過各種途徑，傳遞信號至骨髓，使得骨髓造血干細胞和祖細胞大量增殖，并且將尚未分化成熟的MDSCs 提前釋放入血，當(dāng)病情穩(wěn)定以后，由于炎性細胞因子的水平降低，可能刺激招募MDSCs 的信號減弱，所以MDSCs 的比例也逐漸降低。

在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)RA 患者的病情越嚴重，MDSCs 的比例越高，增多的MDSCs 似乎未能有效抑制其病情。我們推測可能隨著病情的加重，炎癥局部的炎性因子水平過高，MDSCs 的抑制能力無法與其抗衡;或者致炎細胞及其分泌的細胞因子阻礙MDSCs 進入炎性局部發(fā)揮抑制作用;或者MDSCs 只是受到炎性信號的反饋刺激，僅僅表現(xiàn)為數(shù)量上的增多，并無抑制功能;或者MDSCs 本身就是一把雙刃劍，在不同的疾病中，扮演不同的角色，促炎或是抑炎。King 等［11]和Milder 等［12]研究表明，內(nèi)源性的MDSCs 并不能抑制自身免疫性疾病的發(fā)展，甚至?xí)又夭∏?。所以，在后續(xù)實驗中，我們將進一步研究MDSCs 在RA 中的具體功能。

CD4+T 細胞的大量浸潤及其亞群的平衡失調(diào)是RA 發(fā)病機制的一個重要環(huán)節(jié)［1-2]。經(jīng)相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，MDSCs 比例與Th1 細胞比例呈負相關(guān)，而與Th2細胞比例無明顯相關(guān)性，表明在RA 患者體內(nèi)，MDSCs 和Th1 細胞功能可能是互相拮抗的，MDSCs 對體內(nèi)Th1/Th2 平衡的調(diào)節(jié)主要在于對Th1 細胞功能的抑制。體外研究［13-14]表明，MDSCs 可抑制Th1 細胞的分化與功能的發(fā)揮。此外，Chou 等［15]指出，MDSCs能促進調(diào)節(jié)性T 細胞(regulatory T celll，Treg)的增殖與分化，降低移植胰島的排斥反應(yīng)，促進移植物存活。在RA 中，MDSCs 抑制功能的發(fā)揮也可能與Treg 細胞有關(guān)，值得進一步研究。

總之，本研究表明，RA 患者外周血中MDSCs 比例增高，且與Th1 細胞呈負相關(guān)，有關(guān)MDSCs 細胞的功能及其與T 細胞亞群的作用機制有待進一步探討。

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