BARF1基因?qū)Ρ茄拾┘毎鸑F-κB信號通路及bcl-2基因表達的影響

徐美琴，李友瓊，張雪怡，褚福營，張宇瓊，陳巧林，成靜，周天戟

(1.江蘇大學基礎(chǔ)醫(yī)學與醫(yī)學技術(shù)學院，江蘇鎮(zhèn)江212013;2.廣西壯族自治區(qū)人民醫(yī)院檢驗科，廣西南寧530022)

EB病毒(Epstein-Barr virus，EBV)屬于皰疹病毒科γ皰疹病毒亞科，1964年首次從非洲兒童的Burkitt淋巴瘤細胞中發(fā)現(xiàn)。研究表明，EB病毒是一種致瘤性病毒，與多種惡性腫瘤密切相關(guān)，如Burkitt淋巴瘤、免疫缺陷患者的機會性淋巴瘤、Hodgkin淋巴瘤、胃癌、鼻咽癌等［1-2］。其中鼻咽癌是一種惡性度極高的人類腫瘤，EB病毒感染率達100%，EB病毒在其發(fā)生中起重要作用［2-3］。BARF1是EB病毒編碼的癌基因，在大多數(shù)鼻咽癌組織中都能檢測到［1，3］，但其所起作用及機制尚不清楚。研究發(fā)現(xiàn)，BARF1能夠抑制上皮細胞的凋亡［4-6］，而細胞凋亡紊亂與腫瘤的發(fā)生發(fā)展具有非常密切的關(guān)系。核轉(zhuǎn)錄因子-κB(NF-κB)信號通路在細胞凋亡調(diào)控中扮演重要角色［7-10］，而bcl-2是 NF-κB的重要靶基因，是細胞凋亡過程中的重要調(diào)節(jié)基因之一。本研究旨在探討B(tài)ARF1對鼻咽癌細胞NF-κB信號通路活性及bcl-2基因表達的影響，以闡明BARF1抑制上皮細胞凋亡的機制。

1 材料和方法

1.1 材料與儀器

人鼻咽癌CEN1細胞系購自中科院上海細胞庫。pSG5-BARF1以及 pSG5空載體穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的CNE1細胞克隆CEN1-BARF1和CEN1-SG各3個，由本室構(gòu)建與保存，經(jīng)RT-PCR鑒定，BARF1表達正常。DMEM(Gibco公司)，胎牛血清(杭州四季青生物技術(shù)有限公司)，F(xiàn)ITC標記的羊抗兔IgG、抗熒光淬滅封片劑(武漢博士德生物有限公司)，RIPA裂解液、ECL 試劑、DAPI染液、兔抗 NF-κB p65 、bcl-2和β-肌動蛋白抗體、HRP標記山羊抗兔IgG、NF-κB的特異性抑制劑Bay11-7082(碧云天生物技術(shù)研究所)，濕式電泳轉(zhuǎn)移系統(tǒng)、Quantity One圖像分析軟件(Bio-Rad公司)，PVDF膜(Millipore公司)，化學發(fā)光成像儀(Sagecreation公司)。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng) CNE1-SG和 CEN1-BARF1細胞用含10% 滅活胎牛血清的DMEM，培養(yǎng)于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中。待細胞長滿后，用含0.1%胰蛋白酶和2 mmol/L EDTA的PBS進行消化傳代，取對數(shù)生長期細胞進行實驗。

1.2.2 熒光抗體染色法檢測NF-κB p65核轉(zhuǎn)位將對數(shù)生長期的細胞接種于蓋玻片，置于6孔細胞培養(yǎng)板內(nèi)，培養(yǎng)至密度為70%左右。抑制試驗則換加含25 μmol/L的 Bay11-7082或DMSO繼續(xù)培養(yǎng)12 h。以PBS洗2遍，用4%低聚甲醛室溫固定1 h后，PBS洗 3遍，每次 10 min。用 0.25%TritonX-100處理10 min以增加細胞膜通透性，加5%BSA室溫孵育1 h以封閉非特異性結(jié)合位點。加兔抗ΝF-κB p65(1∶200稀釋)抗體4℃孵育過夜，次日PBS洗3遍，每次10 min，加FITC標記的羊抗兔IgG(1∶200稀釋)，室溫孵育40 min，PBS洗3遍，每次10 min，DAPI復染10 min，PBS 洗3 遍，每次10 min，以封片劑封片后于熒光顯微鏡下觀察記錄結(jié)果。

1.2.3 蛋白質(zhì)印跡法檢測bcl-2蛋白的表達 細胞培養(yǎng)至密度為70%左右，抑制試驗則換加含25 μmol/L的Bay11-7082或DMSO繼續(xù)培養(yǎng)12 h。以PBS洗2遍，用RIPA裂解液提取細胞總蛋白，以BCA試劑盒測定蛋白濃度，按說明書進行操作。按每孔30 μg總蛋白上樣進行SDS-PAGE凝膠電泳，凝膠濃度為12%，采用濕式電泳轉(zhuǎn)移系統(tǒng)轉(zhuǎn)移至0.45 μm孔徑的PVDF膜，以含5%脫脂奶粉的TBS室溫封閉1 h，加兔抗bcl-2抗體(1∶1 000稀釋)4℃孵育過夜，次日以TBS-T洗3遍，每次10 min后，加HRP標記的羊抗兔IgG(1∶5 000稀釋)室溫孵育2 h，TBS-T洗3遍，每次10 min，加ECL試劑，在化學發(fā)光成像儀下記錄影像。PVDF膜洗去Bcl-2抗體及二抗后，重新與β-肌動蛋白抗體(1∶1 000稀釋)及二抗反應。以Quantity One軟件分析蛋白條帶密度，經(jīng)β-肌動蛋白校正上樣量后進行統(tǒng)計分析。

1.2.4 統(tǒng)計分析 采用SPSS 11.5軟件包進行統(tǒng)計分析。實驗數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差表示，組間均數(shù)的比較采用 t檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 CNE1-BARF1 中 NF-κB p65 的核轉(zhuǎn)位現(xiàn)象

熒光抗體染色結(jié)果顯示，NF-κB p65呈綠色熒光，而細胞核呈藍色。CNE1-SG中p65主要分布于胞質(zhì)區(qū)域，而胞核區(qū)較少;CEN1-BARF1中p65主要分布于細胞核區(qū)域，而胞質(zhì)區(qū)較少。經(jīng)Bay11-7082處理后，細胞核區(qū)p65減少，而胞質(zhì)區(qū)增加。見圖1。

圖1 熒光抗體染色法分析CNE1-BARF1細胞中NF-κB p65 的核轉(zhuǎn)位Fig 1 The nuclear translocation of NF-κB was analyzed by fluorescence antibody staining in CEN1-BARF1

2.2 CNE1-BARF1中Bcl-2蛋白的表達

蛋白質(zhì)印跡結(jié)果顯示，CNE1-BARF1中Bcl-2蛋白的表達量顯著高于 CNE1-SG(t=3.89，P＜0.05)，經(jīng)Bay11-7082 處理后則顯著下降(t=3.13，P ＜0.05)。見圖2。

圖2 蛋白質(zhì)印跡法分析CNE1-BARF1細胞中Bcl-2蛋白的表達Fig 2 Bcl-2 protein expression was analyzed by Western blot in CEN-BARF1

3 討論

BARF1基因存在于EB病毒基因組的BamH IA片段內(nèi)，編碼相對分子質(zhì)量為(31～33)×103的分泌型蛋白［11］。多種細胞上的研究表明，BARF1具有很強的促有絲分裂原活性，能抑制細胞凋亡、促進細胞增殖和誘導惡性轉(zhuǎn)化，具有明顯的致癌活性［4，5，12-13］，但其機制尚不清楚。

細胞凋亡是多細胞生物體內(nèi)的一種重要的自穩(wěn)機制，在精確調(diào)控特定細胞的數(shù)量及清除具有潛在危險性的細胞等方面發(fā)揮重要作用。細胞凋亡的異常與多種人類疾病密切相關(guān)，在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起重要作用。多種外界因素可以影響細胞凋亡的過程，它們通過一定的信號轉(zhuǎn)導途徑將胞外刺激信號轉(zhuǎn)換成細胞應答反應，從而實現(xiàn)對細胞凋亡的調(diào)控，ΝF-κB信號通路即是其中最為常見的一條。

NF-κB 家族主要包括 NF-κB1(p50/p105)，NF-κB2(p52/p100)，RelA(p65)，RelB，c-Rel等 5 個成員，其亞基間可以通過相互作用形成同源或異源二聚體，p50-p65是其中最為常見的形式。細胞在靜息狀態(tài)下，NF-κB與其抑制蛋白IκB結(jié)合組成異源多聚體，以無活性的狀態(tài)存在于細胞質(zhì)中。當細胞受到NF-κB激活劑刺激時，IκB被磷酸化引起構(gòu)象改變從而與NF-κB解離，釋放出NF-κB，游離的NF-κB從細胞質(zhì)易位至細胞核內(nèi)，發(fā)揮轉(zhuǎn)錄因子活性，從而調(diào)節(jié)其下游靶基因的表達，引起細胞狀態(tài)的改變。NF-κB是細胞凋亡調(diào)節(jié)過程中起關(guān)鍵作用的轉(zhuǎn)錄因子，因而與許多腫瘤的發(fā)生密切相關(guān)。研究表明，許多腫瘤組織中存在 NF-κB的異?；罨?-10］。受NF-κB通路調(diào)控的下游靶基因有很多，其中包括一些具有凋亡調(diào)節(jié)作用的基因，bcl-2是其中最為重要的成員之一［14-15］。許多腫瘤組織中存在bcl-2的過表達，其中不少緣于NF-κB通路的異常激活［15］。

多種致癌因子可以引起NF-κB通路的活化。已有研究表明，BARF1可以通過上調(diào)bcl-2基因表達抑制上皮細胞的凋亡［6，16］，但其機制尚不清楚。本研究結(jié)果顯示，CNE1細胞中表達BARF1后引起了明顯的NF-κB核轉(zhuǎn)位和bcl-2基因表達增加，且采用NF-κB的特異性抑制劑Bay11-7082處理后，bcl-2表達明顯下降，表明BARF1基因激活了CNE1細胞的NF-κB信號通路，引起了其下游靶基因bcl-2的表達增加，進而抑制了其凋亡進程。

細胞凋亡相關(guān)的信號通路調(diào)節(jié)是一個非常復雜的過程，BARF1通過哪些上游途徑活化了NF-κB，以及是否還通過其他途徑介導了BARF1對bcl-2表達的上調(diào)等問題尚待進一步研究。

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