促紅細(xì)胞生成素在人乳腺癌細(xì)胞株中的表達(dá)及作用

晉雯，張小容，孔令英

(福建醫(yī)科大學(xué)病理學(xué)系，福建福州350004)

重組人促紅細(xì)胞生成素(recombinant human erythropoietin，rh-EPO)于1986年應(yīng)用于臨床，主要用于腫瘤相關(guān)性貧血、鐮刀形紅細(xì)胞貧血、重大整形外科手術(shù)伴發(fā)貧血等疾病的治療。但Bennett 等［1]2008年的薈萃分析顯示，EPO 類藥物可使靜脈血栓栓塞(VTE)危險(xiǎn)增加57%，死亡危險(xiǎn)增加10%，但是增高的死亡危險(xiǎn)并不能用增高的VTE 發(fā)生危險(xiǎn)來(lái)解釋。EPO 類藥物影響患者生存的確切機(jī)制還不清楚。最近一些研究表明［2]，EPO 及其受體(EPO-R)在多種惡性腫瘤組織中表達(dá)，且與刺激腫瘤增殖、抑制凋亡，促進(jìn)腫瘤血管形成等有關(guān)，所以EPO類藥物在癌癥患者應(yīng)用中的安全性令人堪憂。但目前對(duì)此存在很大的爭(zhēng)議，因此，有必要進(jìn)一步研究rh-EPO 在調(diào)控腫瘤生長(zhǎng)、血管生成和凋亡中的機(jī)制。本實(shí)驗(yàn)選擇合適的rh-EPO 濃度作用于乳腺癌細(xì)胞，檢測(cè)后者增殖、凋亡及轉(zhuǎn)移等生物學(xué)行為的變化，探討EPO、EPO-R 在乳腺癌發(fā)生發(fā)展中的作用。

1 材料與方法

1.1 材料

人乳腺癌MCF-7 細(xì)胞購(gòu)自上海中科院細(xì)胞庫(kù)，MDA-MB-231 細(xì)胞株由福建醫(yī)科大學(xué)藥理學(xué)實(shí)驗(yàn)室提供。DMEM 培養(yǎng)基、L-15 培養(yǎng)基、10%胎牛血清(Hyclone 公司);Trizol 液(Invitrogen 公司)，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(日本TaKaRa 公司)，PCR 試劑盒(北京博邁德公司)，EPO、EPO-R 引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司設(shè)計(jì)合成;兔抗人EPO 多克隆抗體(Abcam 公司)，鼠抗人EPO-R 單克隆抗體(Abcam公司);EnVision 試劑盒(邁新公司);配膠試劑盒(上海碧云天生物技術(shù)有限公司)，甲基噻唑藍(lán)四氮唑鹽(MTT)為Biosharp 公司產(chǎn)品，ELISA 試劑盒(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)，rh-EPO(益比奧，沈陽(yáng)三生制藥有限責(zé)任公司)。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 人乳腺癌MCF-7 和MDA-MB-231細(xì)胞均為單層貼壁細(xì)胞，在37 ℃，5% CO2環(huán)境下常規(guī)培養(yǎng)。MCF-7 細(xì)胞用含10%胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)液培養(yǎng)，MDA-MB-231 細(xì)胞使用含10%胎牛血清的L-15 培養(yǎng)液培養(yǎng)，穩(wěn)定傳代2d 后備用。

1.2.2 免疫細(xì)胞化學(xué)檢測(cè)EPO 和EPO-R 蛋白的表達(dá) 人乳腺癌MCF-7 和MDA-MB-231 細(xì)胞經(jīng)細(xì)胞爬片后，采用EnVision 方法檢測(cè)EPO 和EPO-R 蛋白的表達(dá)。胞質(zhì)及胞膜有棕黃色顆粒為陽(yáng)性。

1.2.3 蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)細(xì)胞EPO 和EPO-R 蛋白的表達(dá) 分別提取各組細(xì)胞總蛋白60 μg 行SDSPAGE 電泳，電轉(zhuǎn)至PVDF 膜，5%脫脂奶粉封閉，分別加入鼠抗人多克隆一抗EPO(1 ∶1000)，兔抗人單克隆一抗EPO-R(1 ∶1000)，4 ℃孵育過(guò)夜。洗膜，加HRP 標(biāo)記的羊抗兔、羊抗鼠二抗(均為1 ∶5000)，孵育2 h，洗膜后加ECL 發(fā)光液，X 線曝光顯影，β-肌動(dòng)蛋白作為內(nèi)參照。蛋白印跡條帶用SensiAnsys 軟件分析。

1.2.4 MTT 比色法檢測(cè)EPO 對(duì)乳腺癌細(xì)胞活性和生長(zhǎng)的影響 將細(xì)胞密度分別為6 ×104/mL、1.5 ×105/mL，100 μL/孔的MCF-7 和MDA-MB-231 細(xì)胞，接種于96 孔板，37 ℃，5%CO2環(huán)境培養(yǎng)24 h。分別加入終濃度為1、10、100、200、300、400 U/mL 的rh-EPO。酶標(biāo)儀測(cè)定570 nm 和630 nm 雙波長(zhǎng)光密度值(D 值)。按公式計(jì)算藥物對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的增殖指數(shù)(PI):PI=實(shí)驗(yàn)組D 值/陰性對(duì)照D 值。

1.2.5 TUNEL 法測(cè)定乳腺癌細(xì)胞的凋亡指數(shù) 細(xì)胞核出現(xiàn)棕色顆粒為陽(yáng)性著色。凋亡細(xì)胞計(jì)數(shù):隨機(jī)取高倍鏡下5 個(gè)視野計(jì)數(shù)，陽(yáng)性細(xì)胞占視野中所有細(xì)胞的百分比即凋亡指數(shù)(AI)，取均值。

1.2.6 Transwell 遷移、侵襲實(shí)驗(yàn) 消化收集MCF-7和MDA-MB-231 細(xì)胞，于小室上室內(nèi)加入180 μL(含1 ×105個(gè)細(xì)胞)上述細(xì)胞懸液。實(shí)驗(yàn)組加入含rh-EPO 的無(wú)血清培養(yǎng)液20 μL，使其終濃度為200、300、400 U/mL，陰性對(duì)照組為無(wú)血清培養(yǎng)液。下室加600 μL 含10%胎牛血清的培養(yǎng)液，置37 ℃，5%CO2遷移實(shí)驗(yàn)培養(yǎng)24 h，侵襲實(shí)驗(yàn)培養(yǎng)48 h。Giemsa染色，顯微鏡下觀察穿膜細(xì)胞，并隨機(jī)取高倍鏡下5個(gè)視野計(jì)數(shù)取均值。

2 結(jié)果

2.1 EPO 和EPO-R 蛋白的表達(dá)

乳腺癌MCF-7 細(xì)胞株和MDA-MB-231 細(xì)胞株均可見到EPO 和EPO-R 蛋白的表達(dá)，EPO 和EPO-R 蛋白的相對(duì)分子質(zhì)量分別約為21000 和55000(圖1)。

圖1 蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)EPO 和EPO-R 蛋白的表達(dá)Fig 1 The protein expression of EPO/EPO-R examined by Western blot

細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞膜內(nèi)可見呈棕黃色或棕褐色細(xì)顆粒(圖2)。

圖2 EPO 和EPO-R 蛋白在兩類細(xì)胞中的表達(dá)(免疫細(xì)胞化學(xué)染色×400)Fig 2 ICC staining of EPO and EPO-R from MCF-7 and MDA-MB-231 cells

2.2 EPO 對(duì)乳腺癌細(xì)胞活性和生長(zhǎng)的影響

MTT 法檢測(cè)未經(jīng)rh-EPO 處理的乳腺癌MCF-7和MDA-MB-231 細(xì)胞增殖活性，結(jié)果顯示，MCF-7 和MDA-MB-231 細(xì)胞的增殖指數(shù)分別為1.40 ±0.28、2.52±0.59，兩組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)，MDA-MB-231 細(xì)胞增殖速度大于MCF-7 細(xì)胞。

MTT 法檢測(cè)經(jīng)rh-EPO 誘導(dǎo)后乳腺癌MCF-7 和MDA-MB-231 細(xì)胞的增殖活性，結(jié)果顯示，rh-EPO對(duì)乳腺癌細(xì)胞株MCF-7 和MDA-MB-231 均有增加細(xì)胞活性和促進(jìn)增殖的效應(yīng)，48 h 內(nèi)影響不明顯(差別無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義)，48 h 后呈時(shí)間劑量依賴性(圖3)，尤其以MCF-7 組明顯。再結(jié)合未經(jīng)rh-EPO處理的MTT 實(shí)驗(yàn)中已證實(shí)的MDA-MB-231 細(xì)胞增殖速度大于MCF-7 細(xì)胞，可以推斷rh-EPO 對(duì)MCF-7 的作用效果強(qiáng)于MDA-MB-231 細(xì)胞。

圖3 不同濃度rh-EPO 對(duì)MCF-7 和MDA-MB-231細(xì)胞增殖能力的影響Fig 3 The proliferation abilities of MCF-7 and MDA-MB-231 cells after exposed to rh-EPO

2.3 兩種乳腺癌細(xì)胞的凋亡指數(shù)

TUNEL 檢測(cè)凋亡細(xì)胞的結(jié)果顯示，rh-EPO 處理MCF-7 和MDA-MB-231 乳腺癌細(xì)胞72 h 后并沒有抑制兩類細(xì)胞的凋亡。對(duì)照組、200 U/L 組、300 U/L 組、400 U/L 組4 組間凋亡指數(shù)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05，表1)。

表1 兩種乳腺癌細(xì)胞株各組凋亡指數(shù)Tab 1 Apoptosis index of two breast cancer cell lines

2.4 各組細(xì)胞株遷移、侵襲能力的比較

Transwell 遷移實(shí)驗(yàn)顯示，rh-EPO 能增加MCF-7和MDA-MB-231 兩種細(xì)胞株24 h 遷移的細(xì)胞數(shù)而且具有時(shí)間劑量依賴性，各組間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05，表2，圖4)。

表2 各組遷移細(xì)胞數(shù)的比較Tab 2 Comparison of the number of migrating cells in each group

Transwell 侵襲實(shí)驗(yàn)顯示，rh-EPO 能增加MCF-7和MDA-MB-231 兩種細(xì)胞株48 h 侵襲穿過(guò)的細(xì)胞數(shù)，具有時(shí)間劑量依賴性，各組間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05，表3，圖5)。

圖4 促紅細(xì)胞生成素對(duì)乳腺癌細(xì)胞遷移力的影響(Gimsa 染色×200)Fig 4 Migration abilities of MCF-7 and MDA-MB-231cells after exposed to rh-EPO

表3 各組侵襲穿過(guò)的細(xì)胞數(shù)比較Tab 3 Comparison of the number of invasion through cells in each group

圖5 促紅細(xì)胞生成素對(duì)乳腺癌細(xì)胞侵襲力的影響(Gimsa 染色×200)Fig 5 Invasion abilities of MCF-7 and MDA-MB-231cells after exposed to rh-EPO

3 討論

促紅細(xì)胞生成素及其受體的主要作用是調(diào)節(jié)紅系的發(fā)生與發(fā)展。但是，近年多項(xiàng)研究報(bào)道了EPO及其受體的轉(zhuǎn)錄體和蛋白在許多腫瘤中也有表達(dá)，主要包括卵巢癌、前列腺癌、腎癌、舌鱗狀細(xì)胞癌、腦膜瘤等［3-7]。另外，Giatromanloaki 等［8]發(fā)現(xiàn)EPO/EPO-R 在子宮內(nèi)膜癌中高表達(dá)，且腫瘤惡性程度越高，EPO/EPO-R 表達(dá)越高。Yasuda 等［9]研究證實(shí)EPO-R 在惡性肺組織中的表達(dá)高于正常肺組織，且對(duì)肺泡上皮的轉(zhuǎn)化可能具有誘導(dǎo)作用。然而，對(duì)于EPO 及其受體在乳腺癌組織中的表達(dá)和功能研究尚少。本實(shí)驗(yàn)采用RT-PCR 技術(shù)和蛋白質(zhì)印跡等方法對(duì)乳腺癌細(xì)胞MCF-7 和MDA-MB-231 中EPO 和EPO-R 的表達(dá)做了初步研究。結(jié)果顯示，無(wú)論在基因水平還是蛋白水平，兩種細(xì)胞株中均有EPO 和EPO-R 的表達(dá)，且EPO 及EPO-R 均定位于細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞膜。通過(guò)MTT 比色試驗(yàn)、TUNEL 法、Transwell 小室法觀察不同濃度rh-EPO 對(duì)這兩種細(xì)胞增殖、凋亡和轉(zhuǎn)移能力的影響，結(jié)果提示外源性的促紅細(xì)胞生成素有可能通過(guò)與EPO-R 結(jié)合作用于乳腺癌細(xì)胞，影響其生長(zhǎng)。

本實(shí)驗(yàn)采用MTT 法檢測(cè)rh-EPO 對(duì)乳腺癌細(xì)胞株MCF-7 和MDA-MB-231 增殖能力的影響。結(jié)果顯示，48 h 后rh-EPO 在一定濃度范圍(1 ～400 U/L)內(nèi)可以呈時(shí)間、劑量依賴性地促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞株MCF-7 和MDA-MB-231 細(xì)胞的增殖，而48 h 內(nèi)rh-EPO 對(duì)細(xì)胞的增殖促進(jìn)作用不明顯，無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。與Peres 等［10]報(bào)道的神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞、Mirmohammadsadegh 等［11]在黑色素瘤MV3 細(xì)胞株中的實(shí)驗(yàn)結(jié)果相一致，即通過(guò)腫瘤細(xì)胞體外培養(yǎng)的方法均觀察到外源性EPO 對(duì)腫瘤細(xì)胞有促增殖的作用。然而李勇等［12]在同樣的實(shí)驗(yàn)中，卻得出相反的結(jié)論，提出EPO 沒有明顯的促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞株MCF-7生長(zhǎng)和增殖作用。同樣的實(shí)驗(yàn)方法、實(shí)驗(yàn)對(duì)象，卻出現(xiàn)矛盾的結(jié)論，是否與實(shí)驗(yàn)室的條件、儀器的敏感性及試劑來(lái)自不同廠家或批次有關(guān)呢?此外本實(shí)驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)，由于MCF-7 細(xì)胞自身的增殖速度弱于MDAMB-231 細(xì)胞，而加藥后兩株細(xì)胞的增殖率未見明顯差異(P＞0.05)，說(shuō)明rh-EPO 對(duì)MCF-7 細(xì)胞(雌激素依賴低轉(zhuǎn)移)的作用強(qiáng)于MDA-MB-231 細(xì)胞(雌激素不依賴高轉(zhuǎn)移)。rh-EPO 對(duì)不同乳腺癌細(xì)胞株的影響差異是否與雌激素有關(guān)還需進(jìn)一步研究。

腫瘤的進(jìn)行性生長(zhǎng)及生長(zhǎng)速度，與腫瘤細(xì)胞的生成和死亡的比例有關(guān)。腫瘤生長(zhǎng)過(guò)程中，由于營(yíng)養(yǎng)供應(yīng)和抗腫瘤反應(yīng)等因素的影響，有些腫瘤細(xì)胞會(huì)死亡，并且常以凋亡的形式發(fā)生。本實(shí)驗(yàn)采用TUNEL 法檢測(cè)rh-EPO 作用于這兩株細(xì)胞后的凋亡情況，結(jié)果表明，rh-EPO 沒有抑制乳腺癌細(xì)胞MCF-7 和MDA-MB-231 凋亡的作用。Sinclair 等［13]報(bào)道rh-EPO 在神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞、腎臟嗜鉻細(xì)胞瘤和心肌細(xì)胞及內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)并沒有發(fā)揮抑制細(xì)胞凋亡和保護(hù)細(xì)胞的作用，這與我們的研究結(jié)果一致。而Mirmohammadsadegh 等［11]研究發(fā)現(xiàn)rh-EPO 可以抑制黑色素瘤細(xì)胞MV-3 的凋亡。提示在不同腫瘤細(xì)胞中rh-EPO 干擾后的病理生理作用可能存在差異，有待進(jìn)一步研究。

侵襲和轉(zhuǎn)移是乳腺癌細(xì)胞的兩個(gè)重要的生物學(xué)特征，是瘤細(xì)胞從原發(fā)瘤脫離后向周圍組織間隙和(或)遠(yuǎn)處組織運(yùn)動(dòng)轉(zhuǎn)移的過(guò)程，包括瘤細(xì)胞穿過(guò)細(xì)胞外基質(zhì)(excellular matrix，ECM)屏障、血管壁基膜(basement membrane，BM)、穿出血管壁進(jìn)入宿主微環(huán)境以及腫瘤細(xì)胞的移動(dòng)等環(huán)節(jié)。本研究采用Transwell法檢測(cè)不同濃度rh-EPO 作用24 h 和48 h后細(xì)胞的遷移和侵襲能力。研究結(jié)果顯示，rh-EPO呈劑量依賴性地增強(qiáng)MCF-7 細(xì)胞和MDA-MB-231細(xì)胞遷移運(yùn)動(dòng)能力和侵襲出聚碳酸酯膜的能力。而在MTT 實(shí)驗(yàn)中已證實(shí)在48 h 內(nèi)rh-EPO 對(duì)細(xì)胞的增殖促進(jìn)作用不明顯。這說(shuō)明rh-EPO 在48 h 范圍內(nèi)對(duì)細(xì)胞體外遷移及侵襲運(yùn)動(dòng)能力的促進(jìn)作用不受rh-EPO 對(duì)細(xì)胞增殖活性的干擾。Abhold 等［14]用rh-EPO 作用于頭頸鱗狀細(xì)胞癌UMSCC-10B 和UMSCC-22B 細(xì)胞株，結(jié)果表明rh-EPO 能顯著提高腫瘤細(xì)胞的增殖能力和侵襲轉(zhuǎn)移能力。Lopez 等［15]以及Hamadmad 等［16]的研究均提示rh-EPO 能促進(jìn)宮頸癌細(xì)胞的增殖、侵襲轉(zhuǎn)移能力，與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。

綜上所述，無(wú)論在基因水平還是蛋白水平，MCF-7 細(xì)胞和MDA-MB-231 細(xì)胞均有EPO 和EPOR 的表達(dá)，且EPO 及EPOR 均定位于細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞膜。rh-EPO 在不影響癌細(xì)胞凋亡的情況下，呈時(shí)間劑量依賴性地提高乳腺癌細(xì)胞MCF-7 和MDA-MB-231 細(xì)胞的增殖活性，并呈劑量依賴性地增強(qiáng)其遷移、侵襲能力。這就提示，在使用rh-EPO 治療惡性腫瘤的貧血過(guò)程中，rh-EPO 即可能參與了乳腺癌的侵襲和轉(zhuǎn)移過(guò)程，隨著病情的進(jìn)展，進(jìn)一步通過(guò)影響癌細(xì)胞的增殖作用來(lái)促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng)，且這種促進(jìn)腫瘤生成的作用與抑制細(xì)胞的凋亡可能無(wú)關(guān)。這也提示EPO/EPO-R 可能成為乳腺癌分子診斷的標(biāo)志物和治療的新靶標(biāo)。至于rh-EPO 通過(guò)什么機(jī)制促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力還需進(jìn)行深入的研究。

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