家兔下腔靜脈血栓99Tc m -膜聯(lián)蛋白Ⅴ顯像的實驗研究

吳大勇 WU Dayong

張文艷 ZHANG Wenyan

邊艷珠 BIAN Yanzhu

胡玉敬 HU Yujing

家兔下腔靜脈血栓99Tc m -膜聯(lián)蛋白Ⅴ顯像的實驗研究

吳大勇 WU Dayong

張文艷 ZHANG Wenyan

邊艷珠 BIAN Yanzhu

胡玉敬 HU Yujing

目的探討99Tcm-膜聯(lián)蛋白Ⅴ（Annexin Ⅴ）進行靜脈血栓顯像及鑒別新鮮與陳舊靜脈血栓的可行性。材料與方法將15只家兔隨機平均分為新鮮血栓組、陳舊血栓組及對照組，每組5只，新鮮血栓組及陳舊血栓組通過手術于下腔靜脈置入螺旋銅絲建立下腔靜脈血栓模型，對照組建立模型后不在下腔靜脈內(nèi)置入銅絲。新鮮血栓組及對照組于術后1 d、陳舊血栓組于術后14 d注射99Tcm-Annexin Ⅴ，分別于注射后30、60、90 min及2 h顯像，勾畫感興趣區(qū)，計算新鮮血栓組及陳舊血栓組血栓與本底放射性計數(shù)比值，對照組計算與血栓組血栓對應的下腔靜脈部位與本底放射性計數(shù)比值，比較新鮮血栓組與陳舊血栓組、對照組血栓與本底放射性計數(shù)比值的差異。顯像結束后處死實驗兔，留存血栓標本行病理檢查。結果新鮮血栓組5只實驗兔血栓部位均呈放射性濃聚影，陳舊血栓組5只實驗兔血栓部位均未見放射性濃聚表現(xiàn)，對照組5只實驗兔下腔靜脈均未見放射性濃聚；新鮮血栓組血栓與本底放射性計數(shù)比值（4.06±0.49）高于陳舊血栓組（2.46±0.38）及對照組對應的下腔靜脈部位與本底放射性計數(shù)比值（2.27±0.24）（t=5.746、7.318, P＜0.05）；新鮮血栓組血栓病理結果提示為新鮮混合血栓，陳舊血栓組血栓為機化混合血栓。結論99Tcm-Annexin Ⅴ有望成為一種新的急性新鮮靜脈血栓顯像劑用于鑒別新鮮與陳舊靜脈血栓。

靜脈血栓栓塞；腔靜脈，下；體層攝影術，發(fā)射型計算機，單光子；有機锝化合物；膜聯(lián)蛋白質(zhì)類；造影劑；疾病模型，動物；兔

深靜脈血栓形成（deep venous thrombosis, DVT）是導致肺動脈血栓栓塞（pulmonary thromboembolism, PTE）的主要原因，51%～71%的下肢DVT可能會發(fā)生PTE[1]。然而，PTE缺乏典型的臨床表現(xiàn)，其漏診率及病死率高，約60%的致死性PTE患者被漏診[2]。急性深靜脈血栓為新鮮混合血栓，其中白色血栓富含活化血小板，活化后的血小板膜表面暴露磷脂酰絲氨酸（phosphatidylserine, PS）[3]，膜聯(lián)蛋白Ⅴ（Annexin Ⅴ）能夠特異性地結合PS[4]。形成時間較長的深靜脈陳舊血栓發(fā)生機化，活化血小板數(shù)量明顯減少。本實驗利用99Tcm-Annexin Ⅴ分別對家兔新鮮及陳舊下腔靜脈血栓模型進行顯像，探討其進行急性新鮮靜脈血栓顯影及用于鑒別新鮮與陳舊靜脈血栓的可行性。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑 GE Millennium VG Hawkeye SPECT儀，CAPINTEC CRC-15R型活度儀，北京原子高科提供鉬锝發(fā)生器。Annexin Ⅴ（Bender Medsystems公司），分析純氯化亞錫（天津市化學試劑三廠），新華1號濾紙、硅膠快速層析濾紙（北京師范大學化學院惠贈），分析純丙酮（天津市富宇精細化工有限公司）。

1.2 實驗動物 清潔級新西蘭家兔15只（購自河北醫(yī)科大學實驗動物中心，合格證號1009032），清潔環(huán)境飼料喂養(yǎng)，體重2.0～2.5 kg，平均（2.25±0.25）kg，雌雄不限。將15只實驗兔隨機平均分為新鮮血栓組、陳舊血栓組及對照組，每組5只。

1.399Tcm-Annexin Ⅴ標記 參照文獻[5]報道的方法，在反應瓶中依次加入30 μg Annexin Ⅴ、500 μl檸檬酸葡萄糖溶液、10 mg/ml酒石酸鉀鈉溶液100 μl、10 μl新鮮SnCl2/HCl（2 mg/ml）溶液，充分搖勻，于4℃冰箱冷藏靜置20 min，然后向反應瓶中加入1 ml高锝酸鈉（99TcmO4-）溶液（1110 MBq/ml），室溫下靜置20 min，完成標記。利用雙體系[新華1號濾紙為固定相、丙酮為展開劑，硅膠快速層析濾紙（ITLG-SG）為固定相、生理鹽水為展開劑]測定99Tcm-Annexin Ⅴ標記即刻、室溫及37℃恒溫箱下保存1、2、3、4、5、8 h放化純。

1.4 家兔下腔靜脈血栓模型制作 參照文獻[6]報道的方法，家兔經(jīng)耳緣靜脈注射3%戊巴比妥鈉（1.0～1.3 ml/kg）麻醉，將麻醉好的家兔固定在手術臺上，右側腹備皮，于右側腹部皮膚切開一4～6 cm長切口，鈍性分離肌肉及腹膜，暴露右腎下極以遠長約4 cm的下腔靜脈，將自制長約3 cm、直徑約2 mm的單股螺旋銅絲穿刺置入下腔靜脈，自制銅絲U形夾于下腔靜脈近心端卡住螺旋銅絲，止血、縫合血管，查看下腔靜脈通暢后，縫合肌肉、皮膚。對照組家兔建立下腔靜脈血栓模型后，下腔靜脈不置入螺旋銅絲。術后肌肉注射80萬U青霉素，家兔于清潔環(huán)境飼養(yǎng)。

1.5 顯像方法與圖像分析 新鮮血栓組與對照組家兔于術后1 d、陳舊血栓組于術后14 d進行99Tcm-AnnexinⅤ顯像。各組實驗兔于注射后30、60、90、120 min行靜態(tài)平面顯像。實驗兔仰臥于檢查床上，SPECT儀配低能高分辨準直器，采集能峰：140 keV，窗寬20%。共采集1000K計數(shù)，矩陣256×256，放大2倍。血栓顯影的實驗兔于血栓顯影最清楚的時間點圖像勾畫血栓部位和右后肢根部（作為本底）等面積感興趣區(qū)（ROI），未顯影實驗兔于60 min顯像圖像勾畫血栓部位和右后肢根部（作為本底）等面積ROI，計算靜脈血栓部位與本底放射性計數(shù)比值。對照組實驗兔于60 min顯像圖像，在與血栓組血栓對應的下腔靜脈部位勾畫ROI，于右后肢根部勾畫等面積的ROI作為本底，計算對應下腔靜脈部位與本底放射性計數(shù)比值。

1.6 病理檢查 顯像完畢后處死實驗兔，新鮮血栓組及陳舊血栓組實驗兔取血栓，用生理鹽水沖洗干凈，紗布沾干，置于福爾馬林溶液中固定，然后行HE染色。

1.7 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 17.0軟件，新鮮血栓組與陳舊血栓組、對照組血栓與本底放射性計數(shù)比值比較采用獨立樣本t檢驗，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.199Tcm-Annexin Ⅴ放化純99Tcm-Annexin Ⅴ在標記即刻、室溫及37℃恒溫保存2 h內(nèi)放化純均高于95%，保存8 h仍高于90%。

2.2 顯像結果 新鮮血栓組5只實驗兔下腔靜脈血栓部位均可以觀察到團狀放射性濃聚影（圖1），血栓開始顯影的時間為30～60 min，均為逐漸增濃之后減淡。陳舊血栓組實驗兔血栓部位及對照組實驗兔下腔靜脈走行區(qū)均未見放射性濃聚（圖2）。新鮮血栓組血栓與本底放射性計數(shù)比值（4.06±0.49）高于陳舊血栓組（2.46±0.38）及對照組對應的下腔靜脈部位與本底放射性計數(shù)比值（2.27±0.24），差異有統(tǒng)計學意義（t=5.746、7.318, P＜0.05）。

2.3 解剖及病理結果 新鮮血栓組實驗兔解剖后肉眼均可見下腔靜脈內(nèi)血栓形成，血栓附著于銅絲上，呈紅白相間（圖3A）；血栓病理顯示均為新鮮混合血栓，顯微鏡下可見珊瑚狀淡紅色血小板小梁，紅細胞分布于小梁間的纖維素網(wǎng)內(nèi)，小梁邊緣黏附有較多的中性粒細胞（圖3B）。陳舊血栓組實驗兔解剖后肉眼亦均可見血栓形成，血栓沿螺旋銅絲紅白相間，但較新鮮血栓組血栓顏色偏暗（圖3C）；血栓病理顯示均為陳舊機化的混合血栓，顯微鏡下見珊瑚狀血小板小梁，小梁間隙可見多量內(nèi)皮細胞分化趨勢細胞，小梁間的纖維素網(wǎng)內(nèi)包含少量紅細胞及較多附著的中性粒細胞，呈機化表現(xiàn)（圖3D）。對照組解剖后下腔靜脈內(nèi)未見血栓形成。

圖1 新鮮血栓組顯像。血栓部位呈放射性濃聚影（箭），逐漸增濃后減淡，注射99Tcm-Annexin Ⅴ后60 min顯影最清晰。A～D分別為注射99Tcm-Annexin Ⅴ后30、60、90、120 min顯影

圖2 陳舊血栓組與對照組顯像（60 min）。A.陳舊血栓組血栓部位未見放射性濃聚；B.對照組下腔靜脈未見放射性濃聚

圖3 A、B.新鮮血栓組血栓肉眼（A）及病理鏡下（B）所見，病理示混合血栓，未見機化表現(xiàn)（HE, ×40）；C、D.陳舊血栓組血栓肉眼（C）及病理鏡下（D）所見，病理示血栓小梁間隙可見多量血管內(nèi)皮細胞分化趨勢細胞，呈機化表現(xiàn)（HE, ×40）

3 討論

PTE的血栓主要來源于DVT，而PTE的高病死率嚴重威脅著人類的健康。在西方國家，DVT和PTE的每年發(fā)病率分別為0.1%和0.05%[7]。急性靜脈血栓主要為新鮮混合血栓，其中混合血栓內(nèi)的白色血栓部分富含活化的血小板；而形成時間較長的靜脈陳舊混合血栓多發(fā)生機化，血栓內(nèi)活化的血小板明顯減少。新鮮靜脈血栓較陳舊機化血栓脫落的風險更大，因此對于急性新鮮靜脈血栓應采取積極的溶栓治療，兩者的鑒別對于臨床制訂治療計劃具有重要意義[8]。

根據(jù)與活化血小板結合的機制不同，血栓活化血小板顯像劑主要有與GPⅡbⅢa受體結合、與P-選擇素結合、與PS結合3類[9]。與GPⅡbⅢa受體結合的顯像劑研究較多[10,11]。Ji等[12]利用99Tcm標記國內(nèi)自行研制的P-選擇素單克隆抗體SZ-51，成功地對新鮮動脈、下肢深靜脈及肺動脈血栓進行顯像，但多肽及單克隆抗體制備成本高，其應用受到一定的限制。與PS結合的血栓顯像劑主要為99Tcm-Annexin Ⅴ，它能夠與活化的血小板表面暴露的PS結合，從而實現(xiàn)對血栓進行顯像。

本實驗觀察到下腔靜脈造模術后1 d左右的新鮮血栓組5只實驗兔99Tcm-Annexin Ⅴ顯像血栓均顯影，新鮮血栓組下腔靜脈血栓/本底放射性計數(shù)比值為4.06±0.49，具有較高的靶本比，血栓能夠清晰地顯像。新鮮血栓組血栓經(jīng)病理證實為新鮮混合血栓。形成時間長的靜脈陳舊混合血栓多發(fā)生機化，血栓活化的血小板明顯減少，血栓血小板表面暴露的PS減少。因此，陳舊靜脈血栓攝取99Tcm-Annexin Ⅴ明顯減少。本實驗中血栓形成14 d的陳舊血栓組血栓均未見顯影，血栓經(jīng)病理證實為陳舊機化血栓。

99Tcm-Annexin Ⅴ用于急性左心房血栓[13]、腹主動脈瘤附壁血栓[14]、感染性心內(nèi)膜炎血栓性贅生物[15]、新鮮動脈血栓[16]顯像的研究已有報道，以上研究的血栓均形成于動脈血液。本實驗結果顯示，活化的血小板較動脈血栓少的新鮮靜脈血栓利用99Tcm-Annexin Ⅴ顯像能夠顯影。本實驗所得平均血栓/本底放射性計數(shù)比值較Sarda-Mantel等[14]研究得到的大鼠腹主動脈瘤模型附壁血栓/本底放射性計數(shù)比值（SPECT: 5.7±0.9）低，可能是因為腹主動脈瘤附壁血栓形成于動脈血液，血栓內(nèi)活化的血小板數(shù)量多，攝取99Tcm-Annexin Ⅴ多，而且斷層顯像比靜態(tài)平面顯像受重疊組織干擾少。同時，本實驗所得平均血栓反斜線本底放射性計數(shù)比值均高于賈支俊等[17]、呂中偉等[18]報道的股動脈血栓/本底放射性計數(shù)比值（分別為3.13、3.68），可能與血栓形成的血管部位、時間長短及感興趣區(qū)勾畫部位不同有關。

99Tcm-Annexin Ⅴ實驗動物活體顯像中新鮮靜脈血栓能夠顯影，且顯示了良好的血栓/本底放射性計數(shù)比值，而陳舊靜脈血栓未能顯影，提示99Tcm-Annexin Ⅴ有望成為一種新的急性靜脈血栓顯像劑，用于鑒別新鮮與陳舊靜脈血栓。

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（責任編輯 張春輝）

99Tc m -Annexin ⅤScintigraphy of Inferior Vena Cava Thrombus in Rabbits

PurposeTo explore the features of99Tcm-Annexin Ⅴ scintigraphy of venous thrombus and its feasibility of discriminating fresh venous thrombus from old one.Materials andMethodsThe rabbits (n=15) were randomly divided into three groups (fresh thrombus group, old thrombus group and control group). The inferior vena cava thrombus models were developed in the rabbits of thrombus groups by inserting screw cooper wire into inferior vena cava. The rabbits of control group received sham operation.99Tcm-Annexin Ⅴ was injected in the rabbits of fresh thrombus group and control group one day after operation; the same was done in the rabbits of old thrombus group 14 days after operation. Planar anterior abdominal images were obtained at 30, 60, 90 and 120 min after99Tcm-Annexin Ⅴ injection in all groups respectively. The ratios of thrombus to background of the two thrombus groups and the ratios of the area correspondent to the thrombus groups to background of the control group were calculated by ROIs counts. Then rabbits were executed, and thrombus was used for pathology examination.Results99Tcm-Annexin Ⅴ uptake in thrombi was clearly visualized in all rabbits of the fresh thrombus group; whilst negative images showed in all rabbits of the old thrombus group and control group. The thrombus to background ratios of the fresh thrombus group (4.06±0.49) were higher than that of the old thrombus group (2.46±0.38), and also higher than the inferior vena cava below inferior pole of right kidney level to background ratios (2.27±0.24) of the control group (t=5.746, 7.318; P＜0.05). All the thrombi of the fresh thrombus group were confirmed as fresh mixed thrombi by HE staining, and those of the old thrombus group were confirmed as old mixed organized thrombi.Conclusion99Tcm-Annexin Ⅴ may become a new acute venous thrombus imaging tracer used to discriminate fresh venous thrombus from old one.

Venous thromboembolism; Vena cava, inferior; Tomography, emissioncomputed, single-photon; Organotechnetium compounds; Annexins; Contrast media; Disease models, animal; Rabbits

河北省人民醫(yī)院核醫(yī)學科 河北石家莊050051

邊艷珠

Department of Nuclear Medicine, Hebei Genral Hospital, Shijiazhuang 050051, China

Address Correspondence to: BIAN Yanzhu

E-mail: hyx8144@126.com

河北省醫(yī)學科學研究重點課題計劃項目（20110224）。

R-33；R445.5

2013-06-04

修回日期：2013-09-11

中國醫(yī)學影像學雜志

2013年 第21卷 第10期：725-728

Chinese Journal of Medical Imaging

2013 Volume 21(10): 725-728

10.3969/j.issn.1005-5185.2013.10.002