氨甲環(huán)酸脂質(zhì)體微泡復(fù)合物的制備及體外超聲顯影的初步研究

李 婷LI Ting

嚴 飛2YAN Fei

靳巧鋒2JIN Qiaofeng

許瑞雪3XU Ruixue

鄭海榮2ZHENG Hairong

李葉闊3LI Yekuo

論著 Original Research

氨甲環(huán)酸脂質(zhì)體微泡復(fù)合物的制備及體外超聲顯影的初步研究

李 婷1LI Ting

嚴 飛2YAN Fei

靳巧鋒2JIN Qiaofeng

許瑞雪3XU Ruixue

鄭海榮2ZHENG Hairong

李葉闊3LI Yekuo

目的制備包封率高、穩(wěn)定性好的氨甲環(huán)酸脂質(zhì)體，并與微泡通過親和素-生物素系統(tǒng)相連制備成脂質(zhì)體微泡復(fù)合物，對該復(fù)合物的相關(guān)性質(zhì)進行評價。材料與方法采用薄膜水化法制備氨甲環(huán)酸脂質(zhì)體，以包封率為指標，通過正交試驗優(yōu)化制備流程，并與微泡相連接，制備脂質(zhì)體微泡復(fù)合物，檢測該復(fù)合物的基本表征特性，并通過超聲顯影及灰階值測量評估聲學(xué)特性。結(jié)果氨甲環(huán)酸脂質(zhì)體制備優(yōu)化組合為二棕櫚酰磷脂酰膽堿、膽固醇、生物素酞化聚乙二醇2000修飾二硬脂酸磷酯酰乙醇胺摩爾比為85∶10∶5，氨甲環(huán)酸溶液5.0%，聲振處理15 min，所得包封率為62.62%；粒徑約為（104.00±1.84）nm，Zeta電位約（-50.50±0.56）mV，穩(wěn)定性良好。氨甲環(huán)酸脂質(zhì)體連接微泡所得復(fù)合物粒徑約（4.56±0.28）μm，顯微鏡下呈圓形，中心透亮，分布較均勻，無黏附聚集。該復(fù)合物的體外聲學(xué)特性主要表現(xiàn)為微泡的顯影特點，這與顯微鏡下觀察結(jié)果相符。隨著復(fù)合物濃度的增加，其超聲顯影效果相應(yīng)地增強，而具體量化的灰階值也相應(yīng)地增大。為避免聲影的干擾，該復(fù)合物體外適宜超聲顯影濃度至少應(yīng)低于1.15×108/ml。結(jié)論該實驗以包封率為指標，優(yōu)化了氨甲環(huán)酸脂質(zhì)體微泡復(fù)合物的制備流程，并通過體外聲學(xué)特性的評估為該復(fù)合物的超聲有效示蹤提供實驗基礎(chǔ)。

氨甲環(huán)酸；微氣泡；脂質(zhì)體；超聲療法；止血；體外研究

氨甲環(huán)酸是一種重要的抗纖溶止血藥物，它通過與纖溶酶原或纖溶酶的賴氨酸結(jié)合位點結(jié)合，競爭性地抑制纖維蛋白的賴氨酸與纖溶酶結(jié)合，發(fā)揮止血作用，可以應(yīng)用于先天性心臟病術(shù)后止血、體外循環(huán)冠狀動脈搭橋術(shù)后止血、肝切除術(shù)中止血、人工流產(chǎn)術(shù)中及術(shù)后止血等。然而，靜脈注射氨甲環(huán)酸可能會引起超敏反應(yīng)、深靜脈血栓、暫時性失明等副作用[1-7]。氨甲環(huán)酸脂質(zhì)體的制備避免了藥物直接接觸血液，具有減少氨甲環(huán)酸副作用的潛能。若能超聲示蹤氨甲環(huán)酸脂質(zhì)體，并于出血部位進行釋藥，則會明顯提高氨甲環(huán)酸的作用效率。本實驗在優(yōu)化制備包封率高、穩(wěn)定性好的氨甲環(huán)酸脂質(zhì)體的同時，將微泡與氨甲環(huán)酸脂質(zhì)體通過親和素-生物素系統(tǒng)進行緊密連接，從而制備氨甲環(huán)酸脂質(zhì)體微泡復(fù)合物，為其超聲有效示蹤提供實驗基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 主要材料與儀器 氨甲環(huán)酸、無水四硼酸鈉、2,4,6-三硝基苯磺酸（TNBS）：阿拉丁公司；膽固醇（CH）：美國Sigma-Aldrich公司；二棕櫚酰磷脂酰膽堿（DPPC）、二硬脂酰磷脂酰膽堿（DSPC）、聚乙二醇2000-二硬脂酸磷酯酰乙醇胺（DSPE-PEG2000）、生物素酞化聚乙二醇2000修飾二硬脂酸磷酯酰乙醇胺（DSPE-PEG2000-Biotin）：美國Avanti Polar Lipids 公司；全氟丙烷（C3F8）：天津核工業(yè)理化研究院；磷酸二氫鉀（KH2PO4）：天津市大茂化學(xué)試劑廠。

納米粒度及電位分析儀：英國Malvern公司；超聲實時分子影像系統(tǒng)：加拿大Visual Sonics公司；顆粒計數(shù)分析儀：美國PSS公司；通臺式離心機：美國Beckman Coulter公司；倒置系統(tǒng)顯微鏡：日本Olympus公司；超聲波清洗機：致微儀器有限公司；多功能酶標儀：美國Bio Tek公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 氨甲環(huán)酸脂質(zhì)體的制備 在制備氨甲環(huán)酸脂質(zhì)體時，分別選取脂質(zhì)的摩爾比（A）、氨甲環(huán)酸濃度（%, B）、聲振時間（min, C）3個因素作為變量，并且每個變量以3個水平進行正交試驗設(shè)計制備氨甲環(huán)酸脂質(zhì)體（表1）。具體步驟：將DPPC、CH、DSPE-PEG2000-Biotin以一定摩爾比（85∶10∶5、75∶20∶5、55∶40∶5）溶解于三氯甲烷中，然后通過氮氣流吹干有機溶劑，并真空干燥處理至少2 h。在干燥脂質(zhì)膜中加入1 ml氨甲環(huán)酸溶液（5.0%、7.5%、10.0%）后，于60℃水浴內(nèi)100%功率聲振處理（5 min、10 min、15 min）至脂質(zhì)溶液澄清。

1.2.2 氨甲環(huán)酸脂質(zhì)體的包封率檢測 參考Manosroi等[8]的方法，取2 μl樣品與5 μl四硼酸鈉溶液（pH=10）混勻，然后避光加入5 μl TNBS（1.7%）并反應(yīng)30 min，加入200 μl KH2PO4溶液（pH=10, 0.1 mol/L）混勻。于415 nm波長處檢測光密度值，通過標準曲線計算藥物量，并計算包封率：包封率其中W游離為游離藥物量，W總為總藥物量。

1.2.3 優(yōu)化氨甲環(huán)酸脂質(zhì)體制備方案及脂質(zhì)體表征分析 依據(jù)正交試驗結(jié)果中包封率最高組合制備氨甲環(huán)酸脂質(zhì)體，計算其包封率，并將所得脂質(zhì)體懸液于納米粒度及電位分析儀內(nèi)進行粒徑及Zeta電位檢測。將脂質(zhì)體懸液于4℃冰箱內(nèi)放置24 h、48 h、72 h后觀察其穩(wěn)定性。

1.2.4 氨甲環(huán)酸脂質(zhì)體微泡復(fù)合物的制備 將DSPC、DSPE-PEG2000、DSPE-PEG2000-Biotin以摩爾比90∶5∶5溶解于三氯甲烷中并混勻，采用薄膜-水化法制備脂質(zhì)體。脂質(zhì)體經(jīng)聲振處理，直至溶液澄清后置換入C3F8，然后機械振蕩，得到生物素化微泡。

取親和素溶液與生物素化微泡孵育，將氨甲環(huán)酸脂質(zhì)體懸液與上述溶液孵育，多次低速離心經(jīng)磷酸鹽緩沖液（pH=7.4）洗滌純化，得到氨甲環(huán)酸脂質(zhì)體微泡復(fù)合物。

1.2.5 氨甲環(huán)酸脂質(zhì)體微泡復(fù)合物表征分析 通過顆粒計數(shù)分析儀檢測氨甲環(huán)酸脂質(zhì)體微泡復(fù)合物的粒徑，將其懸液稀釋后通過倒置顯微鏡于200倍明視野下觀察其形態(tài)及分散性。

1.2.6 氨甲環(huán)酸脂質(zhì)體微泡復(fù)合物聲學(xué)顯影 將氨甲環(huán)酸脂質(zhì)體微泡復(fù)合物懸液稀釋后，注入軟管內(nèi)。體外經(jīng)超聲實時分子影像系統(tǒng)（頻率40 MHz，增益30 dB，深度10.00 mm，寬度14.08 mm）實時觀察顯影效果，并通過Photoshop 7.0軟件對圖像灰階值進行分析。

2 結(jié)果

2.1 氨甲環(huán)酸脂質(zhì)體包封率檢測 對表1進行正交分析，結(jié)果顯示，包封率的影響因素A＞B＞C。而A因素水平k1＞k3＞k2，B因素水平k1＞k2＞k3，C因素水平k3＞k2＞k1。優(yōu)化組合為A1B1C3，即DPPC、CH、DSPE-PEG2000-Biotin摩爾比為85∶10∶5，氨甲環(huán)酸溶液5.0%，聲振處理15 min。以優(yōu)化組合制備氨甲環(huán)酸脂質(zhì)體所得包封率為62.62%。見表2。

表2 正交試驗結(jié)果

2.2 氨甲環(huán)酸脂質(zhì)體表征分析 氨甲環(huán)酸脂質(zhì)體懸液外觀呈淺白色均一半透明狀，4℃冰箱內(nèi)放置24 h、48 h、72 h后觀察脂質(zhì)體懸液未見沉淀生成及分層。粒徑約為（104.00±1.84）nm。脂質(zhì)體表面帶負電荷，Zeta電位約（-50.50±0.56）mV，典型電位分布見圖1。

2.3 氨甲環(huán)酸脂質(zhì)體微泡復(fù)合物表征分析 顆粒計數(shù)分析儀檢測氨甲環(huán)酸脂質(zhì)體微泡復(fù)合物粒徑約（4.56±0.28）μm。顯微鏡下觀察復(fù)合物呈圓形，中心透亮，分布較均勻，無黏附聚集（圖2）。

2.4 氨甲環(huán)酸脂質(zhì)體微泡復(fù)合物超聲顯影 將純化后的氨甲環(huán)酸脂質(zhì)體微泡復(fù)合物懸液分別稀釋至濃度為7.11×106/ml、2.76×107/ml、1.15×108/ml、5.05×108/ml后，實時超聲顯影及相應(yīng)灰階值測量見圖3，而在濃度為1.15×108/ml（圖3C）和5.05×108/ml（圖3D）時會由于氣體的強反射而產(chǎn)生聲影，導(dǎo)致軟管下壁圖像消失。由此可見，隨著復(fù)合物濃度的增加，超聲顯影效果也相應(yīng)地增強，但過高的濃度產(chǎn)生的聲影會影響圖像的顯影效果。

圖1 氨甲環(huán)酸脂質(zhì)體Zeta電位分布

圖2 顯微鏡下見氨甲環(huán)酸脂質(zhì)體微泡復(fù)合物主要表現(xiàn)為微泡形態(tài)，呈圓形，中心透亮，無黏附聚集（×200）

圖3 氨甲環(huán)酸脂質(zhì)體微泡復(fù)合物超聲顯影及灰階值測量。A～D分別為氨甲環(huán)酸脂質(zhì)體微泡復(fù)合物懸液稀釋濃度為7.11×106/ml、2.76×107/ml、1.15×108/ml、5.05×108/ml后實時超聲顯影所見；E～H分別為A～D矩形框內(nèi)對應(yīng)灰階值測量結(jié)果即92.44±25.16、144.71±26.61、159.68±21.44、167.21±25.63

3 討論

隨著超聲分子影像技術(shù)的發(fā)展，超聲微泡載藥治療受到越來越廣泛的關(guān)注。超聲的空化效應(yīng)可以激發(fā)微泡促進所攜帶藥物的釋放[9]。Klibanov等[10]將脂質(zhì)體內(nèi)包封親水性熒光染料鈣黃綠素，并與微泡相連，利用超聲激發(fā)微泡技術(shù)，證實被包封的鈣黃綠素能在體外有效釋放。大量實驗將此技術(shù)應(yīng)用于腫瘤治療的相關(guān)研究，然而用于止血研究尚不多見。本實驗借鑒此技術(shù)，將脂質(zhì)體內(nèi)包封親水性止血劑氨甲環(huán)酸，制備氨甲環(huán)酸脂質(zhì)體，然后通過與微泡相連接制備脂質(zhì)體微泡復(fù)合物，旨在為該復(fù)合物的超聲示蹤及微泡激發(fā)釋藥提供實驗基礎(chǔ)，并為氨甲環(huán)酸的止血應(yīng)用提供新的思路。

鑒于國內(nèi)氨甲環(huán)酸脂質(zhì)體的制備研究尚不多見，本實驗采用常用的脂質(zhì)體制備方法——薄膜水化法，實現(xiàn)氨甲環(huán)酸脂質(zhì)體的制備。為了提高脂質(zhì)體包封率，優(yōu)化制備流程，實驗中主要選擇影響脂質(zhì)體包封率的重要因素磷脂與CH的比例、藥物濃度、聲振時間進行了正交試驗。實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)，上述因素對氨甲環(huán)酸脂質(zhì)體包封率的影響大小依次為：磷脂與CH的比例＞藥物濃度＞聲振時間。脂質(zhì)體制備中加入一定比例的CH能夠增加雙分子膜中分子的排列緊密程度，而合成磷脂DPPC與普通的卵磷脂相比，具有高度飽和及脂肪鏈長的特點，這均有助于提高脂質(zhì)體的包封率及穩(wěn)定性。因此，本實驗選用DPPC、CH、DSPE-PEG2000-Biotin作為脂質(zhì)體制備的基本材料。結(jié)果表明，DPPC、CH、DSPE-PEG2000-Biotin以一定摩爾比混合對包封率的影響為85∶10∶5＞55∶40∶5＞75∶20∶5。一般認為水溶性好的藥物包封率較高，本實驗分別采用5.0%、7.5%、10.0%氨甲環(huán)酸水溶液進行脂質(zhì)體制備，實驗結(jié)果進一步證實，對于包封率的影響5.0%氨甲環(huán)酸溶液＞7.5%氨甲環(huán)酸溶液＞10.0%氨甲環(huán)酸溶液。脂質(zhì)體制備中的聲振處理能夠使得脂質(zhì)體混懸液中較大的多室脂質(zhì)體轉(zhuǎn)化為較均勻的較小粒徑的單室脂質(zhì)體，而使得懸液更加穩(wěn)定。然而，聲振時間過長會引起磷脂相變破壞脂質(zhì)體的結(jié)構(gòu)，而致使脂質(zhì)體內(nèi)藥物滲漏[11]，本實驗中對包封率的影響聲振處理時間15 min＞10 min＞5 min。因此，本實驗得出氨甲環(huán)酸脂質(zhì)體制備的優(yōu)化組合為DPPC、CH、DSPE-PEG2000-Biotin摩爾比為85∶10∶5，氨甲環(huán)酸溶液5.0%，聲振處理15 min。

對于脂質(zhì)體微泡復(fù)合物的制備，為了提高脂質(zhì)體與微泡的連接效率，本實驗選用特異性較強、穩(wěn)定性較好、應(yīng)用較廣泛的生物學(xué)技術(shù)——親和素-生物素系統(tǒng)作為連接手段。氨甲環(huán)酸脂質(zhì)體微泡復(fù)合物的相關(guān)表征結(jié)果顯示，該復(fù)合物粒徑適宜，顯微鏡下形態(tài)主要表現(xiàn)為微泡形態(tài)，具有良好的分散性，符合常規(guī)超聲造影劑的基本要求。此外，體外超聲顯影實驗表明：一方面，氨甲環(huán)酸脂質(zhì)體連接微泡制備成復(fù)合物后，其顯影效果主要表現(xiàn)為微泡的顯影特點，這與顯微鏡下觀察結(jié)果相符，復(fù)合物濃度增加會提高顯影效果，具體的量化表現(xiàn)為對應(yīng)灰階值的相應(yīng)增大，初步證實了該復(fù)合物的超聲示蹤可行性；另一方面，過高的復(fù)合物濃度會產(chǎn)生明顯的聲影而影響聲場后方的顯影效果，因此依據(jù)實驗結(jié)果，氨甲環(huán)酸脂質(zhì)體微泡復(fù)合物體外適宜超聲顯影濃度至少應(yīng)低于1.15×108/ml。

此外，本實驗主要探討了氨甲環(huán)酸脂質(zhì)體制備中影響包封率的部分重要因素，并以此為基礎(chǔ)優(yōu)化制備氨甲環(huán)酸脂質(zhì)體微泡復(fù)合物。然而，氨甲環(huán)酸脂質(zhì)體微泡復(fù)合物制備的最終目的是止血應(yīng)用，因此該復(fù)合物在制備過程中的其他影響因素及止血研究仍然需要進一步深入探索。

[1] 王麗紅, 鐘慧, 鄧萌, 等. 氨甲環(huán)酸在嬰兒先心手術(shù)中的應(yīng)用. 中國臨床醫(yī)學(xué), 2010, 17(1): 123-125.

[2] 連春微, 李輝, 李茜, 等. 氨甲環(huán)酸在體外循環(huán)冠脈搭橋手術(shù)中應(yīng)用效果的系統(tǒng)評價. 中國循證醫(yī)學(xué)雜志, 2011, 11(2): 150-160.

[3] 楊紅明, 李兵, 殷巍, 等. 氨甲環(huán)酸對減少肝切除術(shù)中出血的臨床研究. 華西醫(yī)學(xué), 2010, 25(9): 1698-1700.

[4] 江琴. 氨甲環(huán)酸片用于人工流產(chǎn)術(shù)止血的臨床觀察. 臨床合理用藥雜志, 2012, 5(29): 21-22.

[5] 馬桂玲. 氨甲環(huán)酸不良反應(yīng)的觀察與分析. 青海醫(yī)藥雜志, 2009, 39(8): 92-93.

[6] 安洪英. 氨甲環(huán)酸致深靜脈血栓3例. 實用醫(yī)藥雜志, 2008, 25(9): 1116.

[7] 盧瑞廷, 何水清. 氨甲環(huán)酸致暫時性失明1例. 中國實用醫(yī)藥, 2012, 7(19): 201-202.

[8] Manosroi A, Podjanasoonthon K, Manosroi J. Stability and release of topical tranexamic acid liposome formulations. J Cosmet Sci, 2002, 53(6): 375-386.

[9] Lentacker I, Geers B, Demeester J, et al. Design and evaluation of doxorubicin-containing microbubbles for ultrasoundtriggered doxorubicin delivery: cytotoxicity and mechanisms involved. Mol Ther, 2010, 18(1): 101-108.

[10] Klibanov AL, Shevchenko TI, Raju BI, et al. Ultrasoundtriggered release of materials entrapped in microbubbleliposome constructs: a tool for targeted drug delivery. J Control Release, 2010, 148(1): 13-17.

[11] 熊偉, 李雄輝, 胡居吾, 等. 薄膜-超聲法制備二氫楊梅素脂質(zhì)體的工藝研究. 食品工業(yè)科技, 2012, 33(5): 254-257.

（責任編輯 張春輝）

Preparation and Ultrasound Imaging of Tranexamic Acid Microbubble-liposome Compound

PurposeTo prepare the tranexamic acid liposome with high encapsulation efficiency and stability, through interaction of avidin and biotin, and to prepare its microbubble-liposome compound whose properties are to be assessed.Materials and MethodsThin film hydration technology was used to prepare tranexamic acid liposome. Taking encapsulation efficiency as indication, the microbubble-liposome compound was optimized by the design of orthogonal experiment. The basic properties of the compound were tested and the acoustic characteristic was measured by ultrasound and gray-scale values.ResultsThe optimum formula of tranexamic acid liposome were as follows: molar ratio of 1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphocholine, cholesterol and 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[biotinyl (polyethylene glycol) 2000] was 85∶10∶5; concentration of tranexamic acid was 5.0%; ultrasonic time was 15 min. The encapsulation efficiency was 62.62%. The size was approximately (104.00±1.84) nm. The Zeta potential was approximately (-50.50±0.56) mV. The liposome was good in stability. The size of the microbubble-liposome compound was approximately (4.56±0.28) μm. Under the microscope, they were round with transparent center, evenly distributed without aggregation. The acoustic characteristic of the compound in vitro showed typical characteristics of microbubble, which was compatible with the results under the microscope. As the concentrations of the compound increased, both ultrasound imaging effect and the gray-scale values enhanced. However, to avoid acoustic shadows, the imaging concentrations were supposed to be at least lower than 1.15×108/ml in vitro.ConclusionThe preparation of the tranexamic acid microbubble-liposome compound can be optimized by taking encapsulation efficiency as reference, and it can be effectively traced by ultrasound according to its acoustic characteristics in vitro.

Tranexamic acid; Microbubbles; Liposomes; Ultrasonic therapy; Hemostasis; In vitro

1.南方醫(yī)科大學(xué) 廣東廣州 510515

2. 中國科學(xué)院深圳先進技術(shù)研究院 廣東深圳 518055

3. 廣州軍區(qū)廣州總醫(yī)院超聲科 廣東廣州510010

李葉闊

Department of Ultrasound, General Hospital of Guangzhou Military Command of PLA, Guangzhou 510010, China

Address Correspondence to: LI Yekuo

E-mail: yekuoli@163.com

全軍醫(yī)學(xué)科研“十二五”計劃課題項目

（CWS12J076）；廣東省科技計劃項目

（2011B080701019，2012B031800309）。

R-33；R445.1

2013-05-07

修回日期：2013-09-21

中國醫(yī)學(xué)影像學(xué)雜志

2013年 第21卷 第10期：721-724

Chinese Journal of Medical Imaging

2013 Volume 21(10): 721-724

10.3969/j.issn.1005-5185.2013.10.001