軟棗獼猴桃多糖的分離純化及抗氧化活性測(cè)定*

宣麗，劉長(zhǎng)江，劉洋

1(沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，遼寧 沈陽(yáng)，110866)2(沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院，遼寧沈陽(yáng)，110866)

軟棗獼猴桃Actinidia arguta(Sieb.et Zucc.)Planch.ex Miq.又名軟棗子、獼猴梨、藤梨，是獼猴桃科、獼猴桃屬多年生落葉藤本植物［1－2］。該樹(shù)種因其葉大而密，花白色并具香味，果實(shí)外表光滑呈翠綠色，植株抗病蟲(chóng)害、抗寒能力強(qiáng)［3－4］，已成為當(dāng)前一種價(jià)值高、用途廣、極具發(fā)展前景的野生果樹(shù)。目前對(duì)軟棗獼猴桃的研究主要集中在種質(zhì)資源［5－7］;花、莖、葉、根中化學(xué)成分與藥理活性的研究與應(yīng)用［8－12］;果實(shí)的貯藏與保鮮［13－15］等方面。多糖是軟棗獼猴桃中主要成分之一，對(duì)其進(jìn)行深入研究對(duì)于軟棗獼猴桃的開(kāi)發(fā)利用有重要意義。

本實(shí)驗(yàn)對(duì)微波輔助提取的軟棗獼猴桃多糖進(jìn)行分離純化，并對(duì)各純化組分的抗氧化活性進(jìn)行了測(cè)定，以期為軟棗獼猴桃多糖的開(kāi)發(fā)利用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 儀器和試劑

軟棗獼猴桃鮮果，采自遼寧省撫順山區(qū);DPPH，美國(guó)Sigma公司;DEAE-纖維素52，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;Sephadex G-100、Sephadex G-200，北京索萊寶科技有限公司;其余試劑為國(guó)產(chǎn)分析純。

U-2910型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)，日立先端科技股份有限公司;Heto-LL 3000凍干機(jī)，賽默飛世爾科技公司;HC23B-AV型微波爐，上海新儀微波化學(xué)科技有限公司;5805型高速冷凍離心機(jī)，德國(guó)艾本德公司;RE-52AA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器，上海亞榮生化儀器廠;HL-2B數(shù)顯恒流泵、BS-100A自動(dòng)部份收集器，上海滬西分析儀器廠有限公司。

1.2 軟棗獼猴桃多糖粗品的制備

軟棗獼猴桃鮮果破碎后采用確定的乙醇除雜工藝:乙醇體積分?jǐn)?shù)80%、料液比1∶2(g∶mL)、時(shí)間60 min，去除軟棗獼猴桃果中大量的色素類雜質(zhì)及還原糖，抽濾，棄去上清液，沉淀部分采用微波輔助提取工藝:料液比 1∶9(g∶mL)、微波處理時(shí)間 10 min、微波功率500 W進(jìn)行提取，提取結(jié)束后，離心獲得的上清液進(jìn)行減壓濃縮，然后用4倍體積的無(wú)水乙醇沉淀，4℃冷藏過(guò)夜，沉淀離心后依次用石油醚、丙酮、無(wú)水乙醇浸泡洗滌，抽濾后冷凍干燥，得微波輔助提取的軟棗獼猴桃多糖粗品。

1.3 軟棗獼猴桃多糖純品的制備

1.3.1 DEAE-纖維素陰離子交換層析分離［16］

將軟棗獼猴桃多糖粗品復(fù)溶(5 mg/mL)，其水溶液經(jīng)DEAE-纖維素柱層析(d 1.6 cm×30 cm)，每次上樣10 mL，依次用蒸餾水、0～1 mol/L NaCl溶液進(jìn)行梯度洗脫，洗脫速度為1.25 mL/min，每管5 mL分部收集，逐管檢測(cè)多糖含量(苯酚-硫酸法A490)、蛋白質(zhì)含量(紫外A280)、核酸含量(紫外A260)，分別收集單一峰組分，透析脫鹽濃縮后，備用。

1.3.2 SephadexG-100凝聚柱層析純化

將DEAE-cellulose-52層析柱分離得到的軟棗獼猴桃多糖組分經(jīng)SephadexG-100(φ1.0 cm×40 cm)凝膠柱進(jìn)行純化。凝膠層析柱先用0.1 mol/L NaCl溶液平衡48 h，再以0.1 mol/L NaCl溶液進(jìn)行洗脫，每次上樣5 mL，流速為0.5 mL/min，每管5 mL分部收集，逐管檢測(cè)多糖含量(苯酚-硫酸法A490)和蛋白質(zhì)含量(紫外A280)，分別收集單一峰組分，透析脫鹽濃縮后，備用。

1.3.3 SephadexG-200凝聚柱層析純化

將SephadexG-100層析柱純化得到的軟棗獼猴桃多糖組分經(jīng)SephadexG-200(φ1.0 cm×40 cm)凝膠柱進(jìn)一步純化。凝膠層析柱先用0.1mol/L NaCl溶液平衡48h，再以0.1mol/L NaCl溶液進(jìn)行洗脫，每次上樣4 mL，流速為0.25 mL/min，每管4 mL分部收集，逐管檢測(cè)多糖含量(苯酚-硫酸法A490)和蛋白質(zhì)含量(紫外A280)，分別收集單一峰組分，透析脫鹽濃縮后，冷凍干燥，得軟棗獼猴桃多糖純品，稱量后備用。

1.4 軟棗獼猴桃多糖純品的抗氧化活性測(cè)定

1.4.1 DPPH自由基清除能力的測(cè)定

［17］，分別配制濃度為 0.0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mg/mL的軟棗獼猴桃多糖純品溶液1 mL，分別加入0.2 mmol/L的DPPH乙醇溶液3 mL，混勻后置暗處，室溫反應(yīng)30 min后，以蒸餾水調(diào)零點(diǎn)，在517 nm處測(cè)定空白管的吸光值A(chǔ)C、樣品管的吸光值A(chǔ)S，Vc為陽(yáng)性對(duì)照。半抑制濃度IC50，根據(jù)濃度-清除率二維曲線上讀取的清除率為50%時(shí)對(duì)應(yīng)的濃度值計(jì)算［18］，按下列公式計(jì)算DPPH自由基的清除率。

式中:AC為空白管的吸光值;AS為樣品管的吸光值。

1.4.2 羥基自由基(·OH)清除能力的測(cè)定

參考文獻(xiàn)［19］分別配制濃度為 0.0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mg/mL的軟棗獼猴桃多糖純品溶液1 mL，分別加入10 mmol/L的FeSO41 mL，10 mmol/L水楊酸-乙醇溶液1 mL，最后加入8.8 mmol/L的H2O21 mL啟動(dòng)反應(yīng)，37℃反應(yīng)30 min，在510nm下測(cè)定空白管的吸光值A(chǔ)C、樣品管的吸光值A(chǔ)S，Vc為陽(yáng)性對(duì)照。半抑制濃度IC50，根據(jù)濃度-清除率二維曲線上讀取的清除率為50%時(shí)對(duì)應(yīng)的濃度值計(jì)算［16］，按下列公式計(jì)算羥基自由基的清除率。

式中:AC為空白管的吸光值;AS為樣品管的吸光值。

1.4.3 超氧陰離子自由基(O－2·)清除能力的測(cè)定

參考文獻(xiàn)［19］分別配制濃度為 0.0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mg/mL的軟棗獼猴桃多糖純品溶液1 mL，分別加入4.5 mL 50 mmol/L pH=8.2的Tris-HC1緩沖液，混勻，于25℃恒溫水浴中保溫20 min，取出后立即加入25 mmol/L鄰苯三酚溶液0.3 mL，迅速搖勻后于25℃恒溫水浴中反應(yīng)5 min，加入8 mmol/L HCl 1 mL，終止反應(yīng)，于320 nm處測(cè)定空白管的吸光值A(chǔ)C、樣品管的吸光值A(chǔ)S，Vc為陽(yáng)性對(duì)照，按下列公式計(jì)算超氧陰離子自由基的清除率。

式中:AC為空白管的吸光值;AS為樣品管的吸光值。

2 結(jié)果與分析

2.1 軟棗獼猴桃多糖的DEAE-cellulose-52陰離子交換層析結(jié)果

由圖1可知，軟棗獼猴桃多糖經(jīng)DEAE-纖維素-52柱分離時(shí)，依次用水、0.1 NaCl、0.2、0.3 mol/L NaCl洗脫出4個(gè)組分，逐管檢測(cè)多糖、蛋白質(zhì)和核酸含量，結(jié)果表明，0.1 mol/L NaCl鹽洗組分中含有少量的蛋白質(zhì)和核酸，其余組分中均未檢出。

圖1 軟棗獼猴桃多糖的DEAE-cellulose-52柱層析洗脫曲線Fig.1 DEAE-cellulose-52 anion-exchange column chromatogram of Actinidia arguta polysaccharide

2.2 SephadexG-100凝聚柱層析結(jié)果

由圖2可知，經(jīng)過(guò)陰離子交換柱層析得到的各多糖組分再經(jīng)過(guò)SephadexG-100凝聚柱層析后，都是只得到一個(gè)洗脫峰且峰形比較對(duì)稱。逐管檢測(cè)蛋白質(zhì)含量，結(jié)果表明每個(gè)組分中均含有極微量的蛋白。

圖2 軟棗獼猴桃多糖各組分SephadexG-100凝聚柱層析洗脫曲線Fig.2 SephadexG-100 column chromatogram of pure fractions after anion-exchange column separation

2.3 SephadexG-200凝聚柱層析結(jié)果

由圖3可知，經(jīng)過(guò)Sephadex G-100凝聚層析柱純化后的各多糖組分再經(jīng)過(guò)Sephadex G-200凝聚柱層析，依然只得到一個(gè)洗脫峰且峰形對(duì)稱，說(shuō)明經(jīng)離子交換柱分離得到的每一部分為具有相同分子質(zhì)量的同一組分，在凝膠柱上不再分離。逐管檢測(cè)蛋白質(zhì)含量，結(jié)果表明每個(gè)組分中都不含有蛋白質(zhì)。收集各組分，以去離子水透析(截留MW14 kDa)，濃縮后冷凍干燥。經(jīng)計(jì)算，水洗組分、0.1鹽洗組分、0.2鹽洗組分和0.3鹽洗組分分別占總洗脫量的14.7%、50.2%、26.1%和9.0%，總回收率為82.4%。0.1鹽洗組分為主要洗脫組分。

圖3 軟棗獼猴桃多糖各組分SephadexG-200凝聚柱層析洗脫曲線Fig.3 SephadexG-200 column chromatogram of pure fractions after SephadexG-100 column separation

2.4 軟棗獼猴桃多糖各純化組分抗氧化活性的測(cè)定

2.4.1 DPPH自由基清除能力的測(cè)定

由圖4可知，隨著樣品濃度的增加，軟棗獼猴桃多糖各純化組分清除DPPH自由基的能力也逐漸增強(qiáng)，表現(xiàn)出明顯的量-效關(guān)系。4個(gè)組分對(duì)DPPH自由基的清除能力為:0.1鹽洗組分＞0.3鹽洗組分＞0.2鹽洗組分＞水洗組分，其中水洗組分的清除能力最弱，當(dāng)該組分濃度為1.0 mg/mL時(shí)，對(duì)DPPH自由基的清除率僅為9.6%。

圖4 軟棗獼猴桃多糖各純化組分對(duì)DPPH自由基的清除率Fig.4 DPPH·-scavenging rate of pure fractions from Actinidia arguta polysaccharide

2.4.2 羥基自由基(·OH)清除能力的測(cè)定

由圖5可知，軟棗獼猴桃多糖水洗組分沒(méi)有清除羥基自由基的能力，3個(gè)鹽洗組分隨著樣品濃度的升高，對(duì)羥基自由基的清除能力逐漸增強(qiáng)，也表現(xiàn)出明顯的量-效關(guān)系。3個(gè)鹽洗組分對(duì)羥基自由基的清除能力為:0.1鹽洗組分＞0.3鹽洗組分＞0.2鹽洗組分。

圖5 軟棗獼猴桃多糖各純化組分對(duì)羥基自由基的清除率Fig.5 OH scavenging rate of pure fractions from Actinidia arguta polysaccharide

由圖6可知，軟棗獼猴桃多糖各純化組分對(duì)超氧陰離子自由基的清除能力很弱。4個(gè)組分中0.3鹽洗組分的清除能力最強(qiáng)，但當(dāng)該組分濃度為2.5 mg/mL時(shí)，對(duì)超氧陰離子自由基的清除率只有20.3%。

圖6 軟棗獼猴桃多糖各純化組分對(duì)超氧陰離子自由基的清除率 mg/mLFig.6 scavenging rate of pure fractions from Actinidia arguta polysaccharide

3個(gè)鹽洗組分和陽(yáng)性對(duì)照Vc清除DPPH自由基和羥基自由基的IC50見(jiàn)表1。

表1 軟棗獼猴桃多糖3個(gè)鹽洗組分與Vc抗氧化活性的比較Table 1 Comparison of antioxidant activity of three brine elution fractions and Vc

由表1可知，3個(gè)鹽洗組分的抗氧化活性為:0.1鹽洗組分＞0.3鹽洗組分＞0.2鹽洗組分，但與Vc相比，還有一定的差距。

3 結(jié)論

(1)微波輔助提取的軟棗獼猴桃多糖經(jīng)DEAE-纖維素層析分離得到4個(gè)組分:水洗組分、0.1鹽洗組分、0.2鹽洗組分和0.3鹽洗組分，這4個(gè)組分經(jīng)SephadexG-100、SephadexG-200凝聚柱層析進(jìn)一步純化，都是只得到一個(gè)洗脫峰且峰形對(duì)稱，表明這4個(gè)組分都為均一多糖，經(jīng)檢測(cè)每個(gè)組分中都不含蛋白質(zhì)。水洗組分、0.1鹽洗組分、0.2鹽洗組分和0.3鹽洗組分分別占總洗脫量的14.7%、50.2%、26.1%和9.0%，總回收率為82.4%。0.1鹽洗組分為主要洗脫組分。

(2)各純化組分的抗氧化活性測(cè)定結(jié)果表明:軟棗獼猴桃多糖具有一定清除DPPH自由基和羥基自由基的能力，對(duì)超氧陰離子自由基的清除能力很弱;鹽洗組分的抗氧化活性明顯優(yōu)于水洗組分;3個(gè)鹽洗組分中0.1鹽洗組分的抗氧化活性最強(qiáng)，0.3鹽洗組分次之，0.2鹽洗組分最弱;0.1鹽洗組分為軟棗獼猴桃多糖中主要的抗氧化活性組分。

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