魚油納米脂質(zhì)體的制備及其性質(zhì)測定*

涂宗財(cái)，張朋，王輝，尹月斌，滿澤洲

1(南昌大學(xué)食品科學(xué)與技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江西南昌，330047)2(江西師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，江西南昌，330022)

魚油因其富含ω-3型多不飽和脂肪酸而成為一種重要的功能食品，比如α-亞麻酸(C18:3n-3)、二十碳五烯酸(EPA)、二十二碳六烯酸(DHA)等。臨床研究已經(jīng)證實(shí)，ω-3型脂肪酸有促進(jìn)大腦發(fā)育、降低患心血管疾病的風(fēng)險(xiǎn)、抗炎抗腫瘤等生理作用［1-3］。然而，由于ω-3型脂肪酸極易發(fā)生氧化，這給它的功能性作用帶來了較大影響。運(yùn)用微膠囊化技術(shù)能夠有效提高魚油的氧化穩(wěn)定性和貯藏時(shí)間，同時(shí)微膠囊的緩釋作用可以提高其消化吸收利用率［4］。

脂質(zhì)體是微膠囊技術(shù)向縱深的發(fā)展，通常指由磷脂構(gòu)成的雙層膜球形小泡，可以包埋親水性、親脂性或兩親性的藥物、營養(yǎng)因子［5］。作為一種載體，其優(yōu)點(diǎn)有:可以同時(shí)包埋親水性和疏水性物質(zhì)，在水中的分散性較好;主要壁材磷脂是生物膜的組成成分之一，生物相容性好，毒性小，安全性高;能夠保護(hù)被包埋物質(zhì)，并起到緩釋作用［6］。目前，脂質(zhì)體技術(shù)已經(jīng)在醫(yī)藥領(lǐng)域得到成熟應(yīng)用，近年來已有學(xué)者關(guān)注其在功能食品領(lǐng)域的應(yīng)用，主要包括了對中鏈脂肪酸、抗氧化、抗菌活性成分和維生素等物質(zhì)的包埋［7-9］。脂質(zhì)體的制備方法比較多，常見的有薄膜分散法［10］，乙醇注入法［11-12］，逆向蒸發(fā)法［13］，凍融法［14］等，這些方法或多或少存在產(chǎn)品粒徑較大、穩(wěn)定性差、有毒有害溶劑殘留等缺點(diǎn)?；谶@些原因，為了使脂質(zhì)體技術(shù)能在食品領(lǐng)域安全、規(guī)模化的應(yīng)用，對傳統(tǒng)制備方法進(jìn)行改進(jìn)將具有重要意義。

動(dòng)態(tài)高壓微射流技術(shù)使流體在振蕩頭中達(dá)到300 m/s以上的速度分成2股或更多股細(xì)流，然后在極小空間進(jìn)行強(qiáng)烈的垂直撞擊或Y型撞擊，在撞擊的過程中瞬間釋放出其大部分能量，產(chǎn)生巨大的壓力降，從而使得液體顆粒高度破碎，能有效降低流體中固體顆粒的粒徑，并且可以實(shí)現(xiàn)連續(xù)化生產(chǎn)［15］。目前，還未見將乙醇注入法和動(dòng)態(tài)高壓微射流技術(shù)相結(jié)合制備脂質(zhì)體的報(bào)道，本研究運(yùn)用乙醇注入-動(dòng)態(tài)高壓微射流法制備魚油納米脂質(zhì)體，優(yōu)化了其制備工藝，并對魚油納米脂質(zhì)體的儲(chǔ)存穩(wěn)定性進(jìn)行了初步研究;避免了有毒有害溶劑的使用，有效的降低了脂質(zhì)體的平均粒徑和多分散指數(shù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

魚油，南京森海生物油脂廠，EPA+DHA＞30%;卵磷脂、膽固醇，上海藍(lán)季科技發(fā)展有限公司;吐溫-80，天津市大茂化學(xué)試劑廠;甲醇、無水乙醇、正己烷、石油醚(沸程60～90)，均為分析純;磷酸鹽緩沖溶液(PBS，pH 6.8，0.05 mol/L)。

1.2 儀器與設(shè)備

V-1001旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，上海愛朗儀器有限公司;Microfluidizer Processor M-110EH微射流儀，美國Microfluidics公司;NICOMP380/ZLS納米粒度分析儀，美國PSS粒度分析儀公司;TGL-10C高速離心機(jī)，上海安亭科學(xué)儀器廠;UV-2450紫外分光光度計(jì)，日本島津公司;H-600透射電鏡，日本日立公司;JD200-3B電子分析天平，沈陽龍騰電子有限公司;透析袋(14 000D)國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 乙醇注入-動(dòng)態(tài)高壓微射流法制備魚油納米脂質(zhì)體

將類脂材料(大豆卵磷脂、膽固醇和魚油)以一定比例溶解于無水乙醇中，然后用注射器將其注入到溶有一定量吐溫-80的pH 6.8的 PBS緩沖液中，在40℃條件下，利用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀使懸浮液中乙醇完全揮發(fā)，即得到粗脂質(zhì)體［11-12］。將粗脂質(zhì)體用動(dòng)態(tài)高壓微射流儀在不同壓力條件下處理不同次數(shù)，即可得到魚油納米脂質(zhì)體。運(yùn)用同樣的方法在不添加魚油的條件下制備空白脂質(zhì)體。

1.3.2 魚油納米脂質(zhì)體包封率的測定

1.3.2.1 吸收波長的確定

將魚油、膽固醇和磷脂分別溶解在石油醚中配成0.6 mg/mL的溶液，取適量上述3種溶液分別放入比色皿中，以石油醚為空白對照，用UV-2450紫外分光光度計(jì)在200～400 nm波長處分別掃描3種溶液。

1.3.2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

配制一系列不同濃度魚油石油醚溶液(0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mg/mL)，以石油醚為空白，在1.3.2.1測得的最佳波長處測定魚油石油醚溶液的吸光度，以魚油的濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.2.3 魚油納米脂質(zhì)體包封率的測定

取20 mL脂質(zhì)體于透析袋中透析16 h除去游離魚油，精密量取10 mL透析內(nèi)液，選用甲醇為破乳劑，用超聲破壁(30 min，功率100 W)，加入石油醚提取，于4 000 r/min離心6 min，取上清液于容量瓶中用石油醚定容，在1.3.2.1測得的最佳波長處測定其吸光度，魚油脂質(zhì)體吸光度為A，空白脂質(zhì)體吸光度為A0，計(jì)算 ΔA(ΔA=A-A0)，根據(jù) 1.3.2.2 得到的線性回歸方程求出包封的魚油質(zhì)量［16-17］;由公式(1)計(jì)算得出包封率。

1.3.3 乙醇注入-動(dòng)態(tài)高壓微射流法制備魚油納米脂質(zhì)體的工藝優(yōu)化

以包封率為指標(biāo)，影響魚油納米脂質(zhì)體包封率的因素較多，對各個(gè)單因素做了考察，脂質(zhì)濃度(10、20、30 、40、50、60 mg/mL)，磷脂與膽固醇質(zhì)量比(2∶1、3∶1、4∶1、5∶1、6∶1)，磷脂與魚油的質(zhì)量比(20∶1、10∶1、10∶2、10∶3、10∶4)，磷脂與吐溫-80 的質(zhì)量比(20∶1、15∶1、10∶1、10∶2、10∶3)，微射流壓力(80、100、120、140、160 MPa)，微射流次數(shù)(0、1、2、3、4、5)。在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，通過極差分析，選取了磷脂濃度、磷脂與魚油的質(zhì)量比、微射流處理壓力、微射流處理次數(shù)4個(gè)對包封率影響較顯著的因素，采用四因素三水平的響應(yīng)面分析方法求取最佳工藝參數(shù)，實(shí)驗(yàn)因素與水平設(shè)計(jì)見表1。

表1 實(shí)驗(yàn)因素水平及編碼Tabel 1 Codes and levels of factors chosen for the trials

1.3.4 魚油納米脂質(zhì)體粒徑和Zeta電位的測定

用Nicomp380/ZLS納米激光粒度分析儀測定。將最佳工藝制備的納米脂質(zhì)體懸浮液稀釋一定倍數(shù)，測定平均粒徑和Zeta電位，樣品平行測定3次。

1.3.5 魚油納米脂質(zhì)體的形貌觀察

運(yùn)用負(fù)染色法對脂質(zhì)體懸浮液進(jìn)行透射電鏡觀察:用蒸餾水將脂質(zhì)體樣品稀釋到大約10 mg/mL，將稀釋后的樣品與20 g/L磷鎢酸以體積比1∶1混合放置2～3 min，將銅網(wǎng)浸入上述液體，并用濾紙吸干多余液體，待自然晾干后，在放大倍率60 000×，工作電壓為75kV的透射電鏡下觀察魚油納米脂質(zhì)體的形態(tài)［18］。

1.3.6 魚油納米脂質(zhì)體穩(wěn)定性考察

取最佳工藝條件制備的魚油納米脂質(zhì)體，分別儲(chǔ)存在-18、4和25℃條件下，考察其包封率和粒徑隨儲(chǔ)存時(shí)間的變化趨勢。

2 結(jié)果與分析

2.1 最佳吸收波長的選擇和標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

如圖1所示，雖然在吸收波長為214 nm處，魚油石油醚溶液有最大吸收峰，但磷脂、膽固醇石油醚溶液在此處也有較強(qiáng)吸收;在274 nm處魚油石油醚溶液有較大吸收峰，磷脂、膽固醇石油醚溶液吸收峰較弱，因此選擇274 nm作為測定魚油納米脂質(zhì)體包封率的吸收波長。在此波長下，按照1.3.2.2的方法得到魚油石油醚溶液的線性回歸方程為A=1.197X+0.031 9，R2=0.997 4。

圖1 魚油、磷脂、膽固醇石油醚溶液的紫外掃描曲線Fig.1 Ultraviolet scanning spectrum of fish oil、soybean phosphatidylcholine and cholesterol

2.2 響應(yīng)面優(yōu)化實(shí)驗(yàn)結(jié)果

進(jìn)行Box-Behnken的四因素三水平實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，對實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸性分析，建立數(shù)學(xué)模型，得到制備魚油納米脂質(zhì)體的最佳工藝條件。響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方案與實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表2。

表2 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 2 Response surface design and test results

2.3 模型的建立及顯著性分析

對表2中的數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸擬合，得到磷脂濃度(A)、磷脂與魚油的質(zhì)量比(B)、微射流壓力(C)、微射流處理次數(shù)(D)與包封率(Y)之間的二次多項(xiàng)回歸方程:Y=72.5+2.95A+3.47B+11.54C+1.50D-1.20 AB+1.30AC+0.05AD-1.22BC+0.55BD-0.10CD-4.52A2-7.91B2-7.21C2-5.92D2。對該回歸模型進(jìn)行方差分析，結(jié)果見表3。

根據(jù)統(tǒng)計(jì)學(xué)知識對方差表進(jìn)行分析，回歸方程模型P值＜0.000 1，說明所選用的二次多項(xiàng)模型高度顯著;模型相關(guān)系數(shù)R2=0.972 8，僅有2.3%的響應(yīng)值總變異不能由此模型解釋，說明該模型能較好地描述實(shí)驗(yàn)結(jié)果;實(shí)驗(yàn)失擬項(xiàng)不顯著，因此可用該回歸方程代替實(shí)驗(yàn)真實(shí)點(diǎn)對實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析;變異系數(shù)(CV)為3.7%，說明實(shí)驗(yàn)有良好的穩(wěn)定性;綜合分析說明可以用此模型來分析和預(yù)測乙醇注入—?jiǎng)討B(tài)高壓微射流法制備魚油納米脂質(zhì)體的工藝結(jié)果。模型一次項(xiàng) A、B、C、D 和二次項(xiàng) A2、B2、C2、D2差異都是顯著的，說明所選因素與響應(yīng)值兩者不是簡單的線性關(guān)系。F值可以反映各因素對實(shí)驗(yàn)指標(biāo)的重要性，F(xiàn)值越大，表明對實(shí)驗(yàn)指標(biāo)的影響越大［19］，由表3可知各因素的主次順序?yàn)?微射流壓力＞磷脂與魚油的質(zhì)量比＞磷脂濃度＞微射流處理次數(shù)。

2.4 響應(yīng)曲面分析及最優(yōu)條件的確定

響應(yīng)曲面越陡峭，表明操作條件對響應(yīng)值的影響越顯著;等高線趨于橢圓則反映2個(gè)因素交互作用顯著。如圖2-C中曲面陡峭程度最大，表明微射流處理壓力、魚油與磷脂質(zhì)量比這2個(gè)因素對包封率的影響比較大，這與單因素的實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致;圖2-A中等高線呈明顯的橢圓形，表明磷脂濃度和魚油與磷脂質(zhì)量比這2個(gè)因素交互作用明顯。

根據(jù)所得模型，預(yù)測最優(yōu)工藝條件為:磷脂濃度29.1 mg/mL，磷脂和魚油質(zhì)量比 10∶2.2，微射流壓力152.5 MPa，微射流次數(shù)2.1次，在此條件下包封率的理論值為77.8%?？紤]到實(shí)際操作的便利，將工藝參數(shù)修正為:磷脂濃度29 mg/mL，磷脂和魚油質(zhì)量比10∶2，微射流壓力150 MPa，微射流處理次數(shù)2次，在此條件下進(jìn)行3次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，得到平均包封率為76.9%，與理論預(yù)測值相比，其相對誤差約為1.2%，說明響應(yīng)面優(yōu)化得到的實(shí)驗(yàn)參數(shù)具有一定的實(shí)用價(jià)值。

表3 回歸模型方差分析Table 3 ANOVA for response surface quadratic model

圖2 不同因素交互作用對魚油納米脂質(zhì)體包封率的影響Fig.2 Response surface plots showing the pairwise interactive effects of different conditions on encapsulation efficiency of fish oil nanoliposomes

2.5 魚油納米脂質(zhì)體粒徑與Zeta電位

粒徑分布通常作為衡量納米脂質(zhì)體穩(wěn)定性的一個(gè)重要指標(biāo)，由圖3得知，最佳工藝條件下脂質(zhì)體的平均粒徑為 128.1 nm，多分散指數(shù)(PDI)為 0.258。在相同配方條件下，未經(jīng)過動(dòng)態(tài)高壓微射流處理的脂質(zhì)體的平均粒徑為 442.6 nm，PDI 0.901。PDI值越小，表明粒徑分布范圍越狹窄，粒度的均勻性也越好;脂質(zhì)體的Zeta電位為-20.11 mV，Zeta電位大意味著脂質(zhì)體雙分子膜表面帶有的電荷越多，聚集時(shí)需要克服的靜電斥力就越大，較大的Zeta電位可以阻礙脂質(zhì)體溶液中的微粒發(fā)生凝聚［11，18］。因此，根據(jù)粒徑、PDI和Zeta電位的測定結(jié)果可以初步預(yù)測魚油納米脂質(zhì)體具有較好的穩(wěn)定性。

圖3 魚油納米脂質(zhì)體的粒徑分布圖和Zeta電位Fig.3 Diameter distribution and Zeta potential of fish oil nanoliposomes

2.6 魚油納米脂質(zhì)體的形貌觀察

透射電鏡觀察表明乙醇注入—?jiǎng)討B(tài)高壓微射流法制備的魚油納米脂質(zhì)體為球形或橢球形，外觀平滑完整，無明顯塌陷和凝聚成團(tuán)，顆粒分布較均勻。

圖4 魚油納米脂質(zhì)體的透射電鏡圖Fig.4 TEM micrograph of fish oil nanoliposomes

2.7 不同儲(chǔ)存溫度下魚油納米脂質(zhì)體穩(wěn)定性考察

由圖5可知，魚油納米脂質(zhì)體在25℃儲(chǔ)存條件下粒徑隨時(shí)間延長顯著增大，發(fā)生了聚集，包封率顯著降低，魚油出現(xiàn)了泄漏情況，這可能是因?yàn)楦邷貤l件下磷脂氧化加劇，造成脂質(zhì)雙分子層結(jié)構(gòu)出現(xiàn)了破損，從而使魚油滲漏。條件為-18℃時(shí)，在第1周內(nèi)脂質(zhì)體的包封率降低較明顯，這主要是因?yàn)楸У男纬珊蜕A破壞了磷脂的膜結(jié)構(gòu)，因此在將脂質(zhì)體溶液進(jìn)行凍干時(shí)，有必要添加一定量的凍干保護(hù)劑［20］。4℃時(shí)脂質(zhì)體粒徑和包封率變化較小，表明在該條件下脂質(zhì)體具有較好的穩(wěn)定性。

3 結(jié)論

(1)利用乙醇注入-動(dòng)態(tài)高壓微射流法制備魚油納米脂質(zhì)體的最佳工藝條件為:磷脂濃度29 mg/mL，磷脂與膽固醇質(zhì)量比4∶1，磷脂與吐溫-80的質(zhì)量比10∶1，磷脂和魚油質(zhì)量比 10∶2，微射流壓力 150 MPa，微射流處理次數(shù)2次，在此條件下脂質(zhì)體的包封率為76.9%。

(2)在最佳工藝條件下脂質(zhì)體的平均粒徑為128.1 nm，多 分 散 指 數(shù) (PDI)0.258，Zeta 電 位-20.11 mV。透射電鏡觀察到脂質(zhì)體為球形或橢球形，外觀平滑完整。在4℃儲(chǔ)存條件下脂質(zhì)體具有較好的穩(wěn)定性。

圖5 不同儲(chǔ)存溫度條件下粒徑和包封率隨時(shí)間的變化趨勢Fig.5 The changing trends of particle size and encapsulation efficiency with various times under the conditions of different storage temperatures

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