耐鹽乳酸菌和酵母菌強化技術(shù)對高鹽稀態(tài)發(fā)酵醬醪品質(zhì)的影響*

崔瑞迎，鄭佳，何菲，張立強，楊松彰，黃鈞，吳重德，周榮清，2，3

1(四川大學(xué)輕紡與食品學(xué)院，四川成都，610065)2(國家固態(tài)釀造工程技術(shù)研究中心，四川瀘州，646000)3(四川大學(xué)制革清潔技術(shù)國家工程實驗室，四川成都，610065)

醬油中復(fù)雜的營養(yǎng)及風(fēng)味物質(zhì)主要源于微生物對原料中蛋白質(zhì)、淀粉及脂肪等的代謝作用［1］。不同種屬微生物生理特性的差異是導(dǎo)致釀造醬油品質(zhì)區(qū)別的主要因素之一。不同耐鹽乳酸菌及酵母菌代謝生成的不同醇類、酯類賦予醬油不同的風(fēng)味［2－4］。隨著現(xiàn)代生物技術(shù)的發(fā)展，傳統(tǒng)發(fā)酵食品的發(fā)展面臨著前所未有的機遇和挑戰(zhàn)，近年來，利用各種微生物菌株純培養(yǎng)物或不同菌株混合培養(yǎng)物強化食品發(fā)酵已成為應(yīng)用生物技術(shù)改造傳統(tǒng)食品發(fā)酵業(yè)研究熱點。Akolka等［5］應(yīng)用 Halobacterium sp.改善魚醬油產(chǎn)品質(zhì)量的研究表明，將該菌懸液接種到醬醪中，不僅可明顯縮短發(fā)酵周期，也顯著改善魚醬油風(fēng)味。Yin等［6］在泡菜生產(chǎn)過程，應(yīng)用Lb.pentosus和Leu.Mesenteriodies的共培技術(shù)顯著降低了泡菜中亞硝酸鹽的含量，同時使腸球菌等腐敗菌的數(shù)量顯著減少，產(chǎn)品風(fēng)味和質(zhì)量也有較大改善。本文首次報道了純培養(yǎng)耐鹽乳酸菌T.halophilus CGMCC 3792、主發(fā)酵酵母菌Z.rouxii CGMCC 3791和產(chǎn)香酵母菌C.versatilis CGMCC 3790對冷溫釀造工藝［3］醬醪釀造過程中酸、醇、酯和酚等4類揮發(fā)性組分以及乙醇、4-乙基愈創(chuàng)木酚等醬油特色揮發(fā)性組分的影響規(guī)律，研究結(jié)果對認識乳酸菌、酵母菌的代謝作用及微生物共培改善醬醪品質(zhì)具有重要借鑒作用。

1 材料與方法

1.1 微生物

米曲霉(Aspergillus oryzae)滬釀3.042:上海迪發(fā)釀造生物制品有限公司;酵母菌Zygosaccharomyces rouxii CGMCC 3791和Candida versatilis CGMCC 3790:本實驗室從百年老字號釀造企業(yè)的醬醪中分離，經(jīng)26S rDNA和ITS區(qū)域序列測序、鑒定、命名并保藏于CGMCC;乳酸菌Tetragenococcus halophilus CGMCC 3792:本實驗室從百年老字號釀造企業(yè)的醬醪中分離，經(jīng)形態(tài)、生理生化特性試驗后經(jīng)16S rDNA測序鑒定，保藏于CGMCC。

1.2 材料

大豆、小麥，本地農(nóng)貿(mào)市場購買。

1.3 主要儀器與設(shè)備

醬醪發(fā)酵罐:不銹鋼罐，自制，容積10 L;DHP-9162電熱恒溫培養(yǎng)箱:上海一恒科學(xué)儀器有限公司;酸度計:PHS-3C精密pH計，上海精密科學(xué)儀器有限公司;固相微萃取頭:CAR/PDMS(75 μm，Supelco，美國);氣-質(zhì)聯(lián)用儀:Trace GC Ultra DSQ II(Thermo，美國)，配備HP-5MS(30.0 m ×250 μm ×0.25 μm，Agilent，美國)毛細管色譜柱。

1.4 實驗方法

1.4.1 醬醪制備

［7］所述方法與步驟，將米曲霉滬釀3.042培養(yǎng)成麩曲種子，等比例加入蒸大豆、碎炒小麥，培養(yǎng)醬油曲。(1)濃度為25%的鹽水冷卻至5℃后，按1.8∶1(質(zhì)量比)與醬油曲混合均勻，維持品溫≤15℃，發(fā)酵30 d后，將品溫逐漸提升至30℃，保溫發(fā)酵，樣品簡稱AC;(2)工藝條件同(1)，發(fā)酵起始時，接入T.halophilus CGMCC 3792的菌懸液，其菌體濃度為5×107CFU/g，樣品簡稱AL;(3)工藝條件同(1)，發(fā)酵3 d時，接入Z.rouxii CGMCC3791菌懸液，其菌體濃度達4.5×106CFU/g，隨后發(fā)酵4 d，接入C.versatilis CGMCC 3790菌懸液，其菌體濃度為5.5×106CFU/g，樣品簡稱 AY。

1.4.2 揮發(fā)性組分的測定

(1)樣品前處理:在檢測前，冷凍的醬醪樣品迅速用乳缽研磨至均勻醬狀。

(2)測定方法及GC-MS條件:揮發(fā)性組分的萃取參考文獻［8］采用 HS-SPME。GC-MS條件:初始溫度40℃，保持5 min，以4℃/min升至100℃，然后以6℃/min升至220℃，保持8 min;進樣口溫度250℃;載氣流速為1.0 mL/min;載氣為高純氦;離子源溫度、連接口溫度分別為230℃和250℃;EI電子能量為70 eV;質(zhì)量掃描范圍為35～400 amu。

(3)揮發(fā)性組分的鑒定及數(shù)據(jù)處理:待測樣品的質(zhì)譜圖通過與標準譜庫(NIST05)比對鑒定，匹配度大于800(最大值為1 000)的結(jié)果才予以報道。使用X-caliber軟件系統(tǒng)對結(jié)果數(shù)據(jù)進行處理，采用峰面積歸一化法確定各組分相對含量。揮發(fā)性組分相對含量以平均值±標準偏差(RSD)(n=3)。

2 結(jié)果與討論

2.1 耐鹽乳酸菌和混合酵母菌強化對醬醪揮發(fā)性組分的影響

圖1中分別是發(fā)酵初始以及發(fā)酵125 d后的各醬醪利用HS-SPME/GC-MS檢出的總離子流圖譜。由圖知，經(jīng)125 d發(fā)酵后各醬醪揮發(fā)性組分的總離子圖譜較初始醬醪有顯著差異，且T.halophilus CGMCC 3792強化、混合Z.rouxii CGMCC 3791和C.versatilis CGMCC 3790強化對揮發(fā)性組分貢獻作用差異明顯。3種不同樣品共檢出45種揮發(fā)性組分，包括酸類(2種)、醇類(5種)、酯類(17種)、酮類(2種)、醛類(5種)、酚類(3種)、呋喃類(2種)、吡嗪類(2種)、其他(7種)等9類組分(表1)。與對照組醬醪相比，2種不同強化方式的醬醪中酸、醇、酚、呋喃和其他等5類組分的相對含量差異較大，而其余4類組分的相對含量接近。因釀造方法不同，本研究檢出的組分中，除2-甲基丁酸、戊酸、乙醇、2-甲基丁醇、1-辛烯-3-醇、苯乙醇、乙酸乙酯、丁二酸二乙酯、辛酸乙酯、苯乙酸乙酯、乙酸苯乙酯、癸酸乙酯、十四酸乙酯、棕櫚酸乙酯、苯甲醛、苯乙醛、4-乙基愈創(chuàng)木酚、4-乙烯基-2-甲氧基苯酚、大馬酮等19種組分外，其余組分與Sun等人［9］的結(jié)果稍有不同。

圖1 醬醪揮發(fā)性組分總離子流圖Fig.1 Total ion chromatogram of volatile compounds in soy sauce moromi

酸、醇、酯等組分具有各自獨特的香味［10］，其相對含量的不同將賦予醬醪不同的風(fēng)味。AL中酸、醇、酮、呋喃、吡嗪和其他等6類組分的相對含量降低，酯、醛和酚等3類組分的相對含量增加(表1)。酚類組分的增加主要源于4-乙基愈創(chuàng)木酚相對含量的增加，4-乙基愈創(chuàng)木酚是醬油中重要的風(fēng)味組分之一，是耐鹽酵母的代謝產(chǎn)物［11］，迄今未見是T.halophilus的代謝產(chǎn)物。但是，AL中4-乙基愈創(chuàng)木酚的相對含量從4.29%提高到 11.19%，增加了1.6倍。T.halophilus CGMCC 3792純培養(yǎng)物強化改善了棲息在醬醪中酵母菌的代謝環(huán)境有利于促進4-乙基愈創(chuàng)木酚的形成，還是乳酸菌自身代謝生成4-乙基愈創(chuàng)木酚，有待進一步探討。酯類組分小幅增加，其中乙酸乙酯、辛酸乙酯和癸酸乙酯等組分的相對含量顯著增加，辛酸甲酯和己酸正己酯等組分的相對含量降幅較大。醇類組分中苯甲醇、苯乙醇相對含量增幅較大，又因其抑制了醬醪中酵母菌繁殖與代謝，使得乙醇等組分的相對含量減少。其他組分相對含量的降低則是萘、甲基萘和2，6－二叔丁基苯醌減少所致。就單組分而言，T.halophilus CGMCC 3792的強化作用使揮發(fā)組分中苯甲醇、苯乙醇、乙酸乙酯、3-(甲硫基)-丙酸乙酯、丁二酸二乙酯、辛酸乙酯、癸酸乙酯、苯甲醛、4-乙基愈創(chuàng)木酚、4-乙烯基-2-甲氧基苯酚、2，3-二氫苯并呋喃等的相對含量增加，且苯甲醇、苯乙醇、乙酸乙酯、丁二酸二乙酯、辛酸乙酯、癸酸乙酯、苯甲醛、4-乙基愈創(chuàng)木酚等提高的相對含量大于30%。苯甲醛的焦糖味［12］、3-(甲硫基)-丙酸乙酯的黃瓜和水果香味［13］有益醬油獨特風(fēng)味的形成，4-乙基愈創(chuàng)木酚是醬醪的重要呈香物質(zhì)之一，其相對含量的增加突出了醬醪的特殊香味。

AY中因Z.rouxii CGMCC 3791使乙醇發(fā)酵作用增強，抑制了雜菌的生長繁殖，其酸類組分的相對含量降低，醇類組分相對含量增加，尤其是苯乙醇的相對含量增高。酯類組分中乙酸乙酯、辛酸乙酯和癸酸乙酯組分的相對含量顯著增加，長鏈脂肪酸乙酯(月桂酸乙酯、棕櫚酸乙酯、亞油酸乙酯等)也有一定幅度增加，雖然苯乙酸乙酯等組分有所降低，但與AL相比，酯類組分仍有較大增幅。AY中戊酸、2-甲基丁醇、1-辛烯-3-醇、苯乙醇、乙酸乙酯、辛酸乙酯、乙酸苯乙酯、癸酸乙酯、月桂酸乙酯、十四酸乙酯、棕櫚酸乙酯、亞油酸乙酯、油酸乙酯、苯乙醛等相對含量增幅較大，且酯類多是大分子酯類，在賦予其酯香和醬香風(fēng)味方面具有重要的作用。2-甲基丁醇具有水果香氣(閾值為 16.0 μg/L)，1-辛烯-3-醇具有濃郁的蘑菇香氣(閾值為 1.5 μg/L)［14－15］，癸酸乙酯(閾值為 200 μg/L)賦予醬油水果香氣并帶有舒適的醋味［16］。

對照組的醬醪中2-甲基丁酸、乙醇、乙酸異戊酯、辛酸甲酯、苯乙酸乙酯、糠醛、二氫-5-戊基-2(3H)-呋喃酮、四甲基吡嗪的相對含量較高。此外，在AL中并未檢出鄰苯二甲酸異辛酯和大馬酮，而在其他兩種醬醪中均有檢出，苯甲醛二甲縮醛在AL、AY中檢出，而對照組并未檢出。由此可見，不同種類微生物菌株純培養(yǎng)物強化醬醪發(fā)酵對改善醬油的風(fēng)味有不同的改善作用。

表1 醬醪揮發(fā)性組分相對峰面積百分數(shù)Table 1 Relative peak area of volatile compounds in soy sauce moromi

續(xù)表1

2.2 主體組分、乙醇及4-乙基愈創(chuàng)木酚變化規(guī)律的研究

比較醇、酯、醛、酚等4類組分發(fā)酵過程的變化趨勢(圖2)知，從0 d至95 d的發(fā)酵過程中，3種類型醬醪中醇類組分呈現(xiàn)非單調(diào)增加的規(guī)律，AY較其他組變化顯著，其中AL醇類組分變化最平緩(圖2a)。酯類組分的變化為，在發(fā)酵初始階段均減少，AY發(fā)酵15 d后迅速升高，35 d后增至小峰值，隨后又減少，75 d時降至低谷，然后急速回升增大。對照組醬醪呈類似的變化規(guī)律，但發(fā)酵55 d時進入小低谷，隨后呈現(xiàn)單調(diào)增加的變化趨勢。AL則是發(fā)酵15 d時降至低谷，后稍有升高，穩(wěn)定后呈現(xiàn)單調(diào)增加的變化規(guī)律(圖2b)。分析醛類組分的變化規(guī)律知，2種強化方式醬醪的變化規(guī)律類似，發(fā)酵第55天時達到峰值，隨時間延長，其相對含量逐漸減少，這可能與酯類及乙醇等組分的相對含量升高有關(guān)，對照組醬醪的變化幅度則相對較小(圖2c)。3種類型醬醪的酚類組分的變化類似(圖2d)，均呈升高-降低-趨于穩(wěn)定的變化趨勢，只是AL降幅較小，AY的降幅較大且迅速。

圖2e和圖2f分別表示3種不同類型醬醪乙醇和4-乙基愈創(chuàng)木酚在125 d發(fā)酵過程中的變化規(guī)律。乙醇呈非單調(diào)增加的變化趨勢，且AL中，乙醇在整個階段的變化幅度低于其他組。4-乙基愈創(chuàng)木酚則呈現(xiàn)單調(diào)增加的變化規(guī)律，在發(fā)酵125 d時，AL較其他組的相對含量顯著增加。由此可見，對于T.halophilus CGMCC 3792是否具有分泌4-乙基愈創(chuàng)木酚的能力以及是否冷溫工藝賦予該菌株合成4-乙基愈創(chuàng)木酚的能力需進一步探究。

圖2 醬醪主體揮發(fā)性組分、乙醇及4-乙基愈創(chuàng)木酚的變化Fig.2 Changes of main volatile compounds，ethanol and p-ethylguaiacol in soy sauce moromi

3 結(jié)論

基于HS-SPME/GC-MS檢測冷溫釀造工藝AL和AY揮發(fā)性組分的研究結(jié)果表明，兩種強化方式均使醬醪中酸類、呋喃和吡嗪類組分的相對含量降低，酯類和醛類組分的相對含量增加。二者區(qū)別在于，AL中醇類、酮類及其他組分的相對含量降低，而酚類組分的相對含量增加，AY中酚類組分的相對含量降低，醇類及其他組分的相對含量增加。對于酯類組分，AL中乙酸乙酯、辛酸乙酯和癸酸乙酯組分的相對含量顯著增加，辛酸甲酯和己酸正己酯的相對含量降幅較大，而AY中辛酸甲酯的相對含量降幅較大，而其長鏈脂肪酸乙酯的相對含量增幅較大。此外AL中4-乙基愈創(chuàng)木酚的相對含量大幅提高，且整個發(fā)酵過程中也單調(diào)增加，需進一步探究其原因。

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