榛子甜菜堿醛脫氫酶基因BADH的克隆及在越冬過程中的表達特性分析

摘要：甜菜堿是高等植物體內(nèi)一種重要的滲透調節(jié)物，甜菜堿醛脫氫酶（Betaine aldehyde dehydrogenase， BADH）是甜菜堿合成的關鍵酶之一，本文基于Solexa技術對平榛花芽轉錄組測序結果的分析采用RACE-PCR技術克隆到一個平榛BADH基因，命名為ChBADH（HQ700873）。ChBADH cDNA 全長1 691 bp，具有一個1 512 bp的潛在編碼區(qū)，編碼503個氨基酸，預測其蛋白質相對分子量547 ku，理論等電點為544。ChBADH具有BADH家族保守的VSLELGGKSP功能活性位點和特征多肽序列，序列比較和生物信息學分析結果顯示ChBADH在保守結構域和其他植物來源的BADH享有高度的一致性。以ACTIN為內(nèi)參，對ChBADH基因在四個時期平榛的表達模式進行了初步的研究，熒光定量結果表明，ChBADH在寒冬時期被強烈的誘導表達，是非冷適應時期的35倍，推測該基因可能與榛子花芽越冬有緊密關系。

關鍵詞：平榛；甜菜堿醛脫氫酶；qRT-PCR；寒冬

中圖分類號：Q785文獻標識號：A文章編號：1001-4942（2013）05-0006-07

低溫是影響植物分布，進而影響生長和產(chǎn)量的關鍵因素之一。 1970年Weiser指出低溫會使植物的基因表達發(fā)生變化[1]，早在20世紀90年代研究者就發(fā)現(xiàn)植物存在冷適應現(xiàn)象[2]。迄今為止，植物抗寒的分子機制還沒完全搞清楚，但研究者總結出了兩條冷調節(jié)的途徑：依賴ABA和非依賴ABA低溫響應方式。通過分子生物學手段培育抗寒種質材料已經(jīng)成為當代植物遺傳改良的研究熱點。

多年生木本植物越冬一般經(jīng)過三個過程：冷適應（秋天）、耐冷時期（冬天）、脫除冷鍛煉（春天），植物經(jīng)過一定時間的非凍低溫（2～6℃）馴化后具有較強的抗寒性[3]，該過程稱為冷適應或者抗寒鍛煉。植物在脅迫條件下體內(nèi)會生成大量的滲透調節(jié)劑，起調節(jié)胞內(nèi)滲透壓、保護胞內(nèi)酶活性的作用。甜菜堿是目前研究最深入的一種滲透調節(jié)物，它的結構、合成途徑相對簡單，遺傳操作方便[4]。植物體內(nèi)膽堿通過兩步不可逆的氧化反應生成甜菜堿，甜菜堿醛脫氫酶（Betaine aldehyde dehydrogenase， BADH）是高等植物體內(nèi)合成甜菜堿的關鍵酶[5]。自Weretilnyk等[6]首先從菠菜中克隆得到BADH基因，先后被轉入煙草[7]、水稻[8]、小麥[9]、番茄[10]、胡蘿卜[11]等植物中，并增強了這些植物的耐鹽性。張寧等（2009）[12]將BADH基因轉入馬鈴薯提高了植株的抗旱耐鹽性。至今，人們已相繼在遼寧堿蓬、大麥[13]、油菜[14]、結縷草[5]等多種植物中分離鑒定了這一基因，并得到了純化蛋白[4]。雖然一些木本植物的BADH序列在NCBI已經(jīng)注冊登錄，但只在麻瘋樹[15]和紅樹林等少數(shù)木本植物中有BADH基因的表達特性分析的報道。

平榛（Corylus heterophylla Fisch）為榛科（Betulaceae）榛屬（Corylus）植物，是世界四大堅果（榛子、核桃、扁桃、腰果）之一，具有極高的營養(yǎng)價值和經(jīng)濟價值，在我國野生分布廣泛。它的主要特性是抗寒性強，可抗冬季-48℃的極端低溫，是我國重要的優(yōu)良抗寒果樹種質資源。世界上廣泛栽培的歐洲榛（Corylus avellana L）和我國發(fā)展的平歐雜種榛（Corylus heterophylla Fisch×Corylus avellana L）的抗寒能力遠不如平榛，早春和晚秋的霜凍會凍傷或者凍死花芽。本研究從平榛花芽轉錄組文庫中檢索到和BADH基因高度同源的Unigene，并采用RACE-PCR技術克隆得到平榛的BADH基因全長，對該基因越冬過程中的表達特性進行分析，旨在為進一步研究平榛BADH基因的功能、探討平榛抗寒性的的分子機制提供理論依據(jù)和基礎數(shù)據(jù)，并為今后進行遺傳改良培育抗寒榛子新品種提供可操作基因。

1材料與方法

11試驗材料

平榛材料采于山東省果樹研究所岱東苗圃，取一個克隆母株上萌發(fā)的基因型一致的根蘗苗。參照Naik等（2007）[16]方法（稍作修改），分別于2011年9月29日（處于非冷適應時期，NC， non-cold acclimation，日均溫7℃以上）、2011年11月2日（處于冷適應時期，CA， cold acclimation，日均溫7℃以下）、2011年12月29日（處于寒冬時期，MW， mid-winter，日均溫0℃以下）、2012年4月24日（處于脫除冷適應時期，DA，deacclimation， 日均溫回升至7℃以上）四個不同時間點摘取花芽，取材后立即投入液氮凍干，存于-80℃冰箱，用于研究自然條件下BADH基因的季節(jié)表達模式。

12試驗方法

121BADH基因的克隆與序列分析平榛研究樣品材料的總RNA提取采用CTAB法[17]，并用DNaseⅠ（TaKaRa）處理以去除基因組DNA的污染。應用Clontech公司的SMARTTM RACE試劑盒反轉錄得到第一鏈用于基因RACE擴增，從平榛花芽轉錄組文庫中篩選得到一條類似BADH基因的序列，Unigene編號為42806，設計擴增3′方向的引物BADH-3R和5′方向的引物BADH-5R（表1），按照Race試劑盒SMARTTM RACE cDNA Amplification Kit說明書進行cDNA末端快速擴增。擴增方法采用Touch down PCR程序，凝膠回收與預期片段大小一致的泳帶，連接克隆載體并轉化感受態(tài)細胞，通過藍白斑篩選及質粒酶切鑒定陽性克隆后，在北京諾賽生物公司進行序列測定。為獲得BADH基因全長，根據(jù)由Unigene序列和兩段末端序列拼接而得到的cDNA全長序列，設計引物BADH-F和BADH-R（表1）進行PCR擴增全長序列，PCR產(chǎn)物克隆到PMD19-T載體上，測序結果在GenBank中進行Blast分析。利用在線軟件ProtParam（http：//www.expasy.org）預測所編碼蛋白的分子量、理論等電點及保守結構域等。采用 DNAMAN軟件進行多序列比對及系統(tǒng)進化分析。

122相對熒光定量PCR表達分析分別提取不同處理材料的總RNA，用DNase I酶（RNase free）消化基因組DNA后，各取05 μg為模板，反轉錄合成cDNA 第一鏈作為實時熒光定量PCR（Quantitative Real-Time PCR，qRT-PCR）的模板。根據(jù)ChBADH cDNA全長序列，按照熒光定量PCR引物設計原則在BADH的3′非翻譯區(qū)附近設計一對特異引物BADH QR-F和BADH QR-R（表1），獲得的擴增片段為178 bp。以平榛Actin基因 （GenBank accession number HQ677569）為穩(wěn)定內(nèi)參，設計其特異引物Actin-F和Actin-R（表1），獲得的擴增片段為101 bp，進行相對熒光定量分析。

反應在ABI 7500實時定量PCR儀上進行，方法參照文獻[18]描述進行，每個試驗設4次重復，利用ABI 7500 PCR儀Sequence Detection software軟件（2-ΔΔCt法）和Origin 62軟件進行數(shù)據(jù)分析。

2結果與分析

21平榛ChBADH cDNA全長的獲得

通過分析采用Solexa 測序技術對寒冬時期平榛花芽轉錄本進行的高通量測序結果，發(fā)現(xiàn) Unigene 42806與棉花BADH具有較高的同源性，設計末端擴增的特異引物，以平榛花芽的cDNA為模板，經(jīng)RACE-PCR擴增和產(chǎn)物克隆、測序后，分別得到長度為702 bp的3′末端和648 bp的5′末端（圖1，條帶1和條帶2）。5′RACE擴增片段、3′RACE擴增片段均與Unigene片段有一段完全重疊的區(qū)域，說明克隆到的是基因的5′端和3′端，最終拼接獲得一條長度為1 691 bp的cDNA全長序列。Blast比對發(fā)現(xiàn)，該cDNA序列與BADH基因同源，命名為ChBADH，GenBank登錄號為HQ700873。利用NCBI的ORF Finder進行分析發(fā)現(xiàn)，ChBADH包含一個長度為1 512 bp的開放讀碼框（ORF），5′非翻譯區(qū)長48 bp，3′非翻譯區(qū)長131 bp。其ORF編碼一個含503個氨基酸的蛋白質，ProtParam預測蛋白的相對分子量為547 ku，理論等電點（pI）為544?；虻腸DNA全長序列及編碼的氨基酸序列如圖2所示。