RNAi介導(dǎo)抗水稻條紋病毒轉(zhuǎn)基因水稻的培育

摘要：本研究根據(jù)RNA干擾的機制原理，利用已構(gòu)建的包含SP基因部分片段反向重復(fù)序列和生物安全性更高的標(biāo)記基因bar基因的RNAi雙元表達載體pDTRSV-IRSP-Bar，通過采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的方法轉(zhuǎn)化水稻愈傷組織獲得抗條紋葉枯病和抗除草劑的轉(zhuǎn)基因水稻植株，通過Basta抗性篩選、PCR檢測及Northern blot分析，獲得了穩(wěn)定高抗RSV和抗Basta的株系KRSV1和KRSV9，并對其田間抗性及農(nóng)藝性狀表現(xiàn)進行了調(diào)查研究。

關(guān)鍵詞：水稻條紋病毒；RNA干擾；反向重復(fù)序列；農(nóng)桿菌介導(dǎo)

中圖分類號：S511.2+23.53文獻標(biāo)識號：A文章編號：1001-4942（2013）05-0038-04

水稻條紋病毒（Rice stripe virus，RSV）是纖細病毒屬（Tenuivirus）的代表成員，由介體灰飛虱以持久性方式經(jīng)卵傳播，該病毒引起的水稻條紋葉枯病具有分布范圍廣、危害極嚴重的特性。在水稻條紋葉枯病流行暴發(fā)年份，能造成水稻大面積減產(chǎn)甚至絕收，化學(xué)防治對其效果不明顯，并且造成環(huán)境污染。因此，選育抗病品種是防治水稻條紋葉枯病的最經(jīng)濟有效的方法。

RSV是一種特殊的多組分RNA病毒，其中日本T分離物全基因組序列已被測定，全長為17 145 nts， 由4條單鏈RNA組成，按照分子量由大到小分別命名為RNA1～RNA4[1～3]。RSV具有獨特的基因組結(jié)構(gòu)和編碼策略，除RNA1采用負鏈編碼策略，vcRNA1編碼依賴RNA的RNA聚合酶（RNA-dependent RNA polymerase， RdRP）外，RNA2、RNA3、RNA4均采取雙義編碼策略，其中確定與病毒致病力和侵染過程密切相關(guān)的是RSV vcRNA3編碼的病毒外殼蛋白（coat protein， CP）和vRNA4編碼的病害特異性蛋白（specific protein，SP）[4～6]。

目前抗RSV品種的培育主要是通過常規(guī)育種結(jié)合分子標(biāo)記輔助選擇，但存在抗性資源缺乏、育種周期長、效率低等問題。隨著近年來RNA干擾（RNA interference， RNAi）機制研究的不斷深入，利用RNAi的高效性和特異性來控制植物的病毒病已開始得到重視和應(yīng)用[7]。生物學(xué)研究表明，RNAi是由內(nèi)源性或外源性雙鏈RNA （dsRNA） 所導(dǎo)致的細胞內(nèi)特異性的基因沉默的現(xiàn)象，主要借助轉(zhuǎn)錄后的加工特異性地降解靶標(biāo)RNA而使基因失活，從而獲得對病毒的抗性，所以也稱為轉(zhuǎn)錄后基因沉默（Post-transcription gene silencing， PTGS）[7，8] 。dsRNA的形成存在多種可能的途徑[9]，但許多研究表明，在植物體內(nèi)產(chǎn)生dsRNA的最佳方法是轉(zhuǎn)化具有發(fā)夾結(jié)構(gòu) RNA（hairpin RNA， hpRNA）的外源基因。具有發(fā)夾結(jié)構(gòu)的外源基因由兩段反向重復(fù)（Inverted repeat， IR）DNA序列和一段其他DNA（spacer）序列組成，兩段IR DNA由spacer連接起來，這樣的結(jié)構(gòu)所轉(zhuǎn)錄的RNA會形成hpRNA?；趆pRNA表達而誘導(dǎo)的基因沉默已在多種生物、基因上獲得成功[10～13]。因此通過體外構(gòu)建hpRNA可以高效地誘發(fā)基因沉默。

本研究利用已構(gòu)建的包含SP基因部分片段反向重復(fù)序列和bar基因的RNAi雙元表達載體pDTRSV-IRSP-Bar，通過采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的方法轉(zhuǎn)化水稻愈傷組織獲得抗條紋葉枯病和抗除草劑的轉(zhuǎn)基因水稻植株，經(jīng)Basta抗性篩選、PCR檢測及Northern blot分析，獲得了高抗RSV和抗Basta的水稻植株，為水稻抗RSV品種的培育奠定了基礎(chǔ)。

1材料與方法