擬南芥轉(zhuǎn)化體篩選中Basta噴灑時(shí)期和濃度試驗(yàn)

張慶霞等

摘要：為了更加方便有效地利用Basta來(lái)篩選帶草銨磷（PPT）抗性Bar基因的轉(zhuǎn)基因擬南芥，對(duì)不同時(shí)期噴灑不同濃度Basta的效果進(jìn)行了研究。結(jié)果表明：擬南芥轉(zhuǎn)化體剛長(zhǎng)出2片真葉時(shí)對(duì)Basta比較敏感，此時(shí)開(kāi)始噴施效果比較好；PPT含量為135%的情況下，稀釋2 000～4 000倍噴施效果好，此時(shí)既可有效篩選出陽(yáng)性苗，又不會(huì)抑制陽(yáng)性苗的生長(zhǎng)；第一次噴施后6天左右移栽陽(yáng)性苗較好，此時(shí)可以明顯區(qū)分出陽(yáng)性苗，且移栽后緩苗快、長(zhǎng)勢(shì)好。

關(guān)鍵詞：擬南芥；噴灑；篩選；Basta；草銨膦（草丁膦，PPT）

中圖分類(lèi)號(hào)：S482.4+9文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)號(hào)：A文章編號(hào)：1001-4942（2013）05-0096-04

擬南芥（Arabidopsis thaliana）作為一種模式植物，具有基因組小、生長(zhǎng)周期短、形體小、繁殖系數(shù)高、易于培養(yǎng)等優(yōu)點(diǎn)[1]，而且基因組測(cè)序已經(jīng)完成[2]。同時(shí)，擬南芥屬十字花科，具有高等植物的一般特點(diǎn)，擬南芥研究中所取得的成果很容易用于其它高等植物包括農(nóng)作物的研究，可產(chǎn)生重大的經(jīng)濟(jì)效益，因此擬南芥的研究越來(lái)越多地受到國(guó)際植物學(xué)界及各國(guó)政府的重視[3]。由于擬南芥轉(zhuǎn)基因操作簡(jiǎn)便，技術(shù)成熟，并且具有各種功能缺失突變體，所以常被用來(lái)做基因功能研究。

在沒(méi)有克隆抗除草劑基因以前，人們一直采用一些對(duì)抗生素具有抗性的基因作為報(bào)告基因，如cat、hyg、npt Ⅱ等[4]。但是抗生素的成本較高，并且會(huì)由于轉(zhuǎn)化細(xì)胞對(duì)抗生素的解毒作用導(dǎo)致交叉保護(hù)，假陽(yáng)性率高[5]。而抗除草劑基因作為報(bào)告基因，其篩選作用明顯， 檢測(cè)方法靈敏， 越來(lái)越受到人們的青睞，Bar基因是其中的代表[6]。

草銨膦（又名草丁膦）屬有機(jī)磷類(lèi)除草劑， 是非選擇性廣譜除草劑Basta的活性成分，在一些文獻(xiàn)中常被稱(chēng)為膦絲菌素（Phosphinothricin，PPT），它通過(guò)植物的葉片或其它綠色部分被快速吸收[7]。草銨膦強(qiáng)烈抑制植物中谷氨酰胺合成酶（Glutamine synthetase， GS）活性，從而導(dǎo)致植物體內(nèi)氮代謝紊亂，銨過(guò)量積累，葉綠體解體，進(jìn)而光合作用受抑制，最終導(dǎo)致植物死亡[8]。

草銨膦抗性Bar基因編碼膦絲菌素乙酰轉(zhuǎn)移酶（Phosphinthricin acetyltransferase，PAT）， PAT使PPT的自由氨基乙?；?，使之不能抑制GS的活性，含有該基因的植物具有對(duì)Basta的抗性[9]。目前在轉(zhuǎn)基因擬南芥中Bar基因表達(dá)的檢測(cè)方法主要有：（1）在含有PPT的選擇培養(yǎng)基上觀察種子的萌發(fā)能力[10]，該方法種子消毒及播種都需要進(jìn)行無(wú)菌操作，過(guò)程比較繁瑣，并且所需的純品PPT價(jià)格昂貴；（2）用PPT溶液進(jìn)行全株噴灑，觀察植株的生存能力[11，12]，該方法不需無(wú)菌操作，操作簡(jiǎn)便，使用市售的農(nóng)用Basta即可，成本較低。但迄今為止，尚未見(jiàn)有關(guān)全株噴灑方法的專(zhuān)門(mén)報(bào)道。本試驗(yàn)對(duì)不同時(shí)期和不同濃度Basta噴灑擬南芥的效果進(jìn)行了研究，為篩選Bar基因?yàn)閳?bào)告基因的轉(zhuǎn)基因植株提供了一定試驗(yàn)參考。