糖尿病大鼠肝纖維化對(duì)血糖變化的影響及其機(jī)制

熊盛池 熊利 余登國(guó)

[摘要] 目的 研究糖尿病所致大鼠肝纖維化對(duì)血糖變化的影響及其機(jī)制。 方法 將大鼠隨機(jī)分為正常組1、2、3，每組12只；模型組1、2、3，每組12只。除正常組外，其余各組用STZ（鏈脲佐菌素）誘導(dǎo)并建立糖尿病SD大鼠模型，將造模成功的DM大鼠隨機(jī)抽樣分成以下3個(gè)組：模型組1、2、3，對(duì)組1、2、3分別干預(yù)處理8周、12周、16周，放射免疫測(cè)定肝纖維化指標(biāo)：透明質(zhì)酸、IV型膠原，測(cè)定空腹、餐后2 h血糖；免疫組織化學(xué)法檢測(cè)肝組織TGF-β1表達(dá)。 結(jié)果 模型組肝纖維化指標(biāo)明顯增高，以模型組3為主；模型組空腹和餐后血糖波動(dòng)明顯，肝臟TGF-β1表達(dá)顯著增高，與正常組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。并且以模型組3差異最顯著（P<0.01）。 結(jié)論 糖尿病大鼠肝纖維化對(duì)血糖有顯著影響，且隨病變加重而明顯，其影響可能與TGF-β1在肝組織的表達(dá)增多有關(guān)。

[關(guān)鍵詞] 糖尿病；肝纖維化；空腹血糖；餐后2 h血糖；轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1

[中圖分類(lèi)號(hào)] R587.1 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 2095-0616（2013）05-34-03

糖尿?。╠iabetes mellitus，DM）是一種以慢性的高血糖持續(xù)升高為主的慢性并發(fā)癥，主要影響心、腦、腎、眼、足，等多部位、多器官受損，但是臨床醫(yī)生及患者卻忽略了糖尿病引起的肝臟病變。臨床工作中糖尿病導(dǎo)致的肝臟病變，引起肝纖維化、肝硬化并不少見(jiàn)[1]，使得患者血糖發(fā)生劇烈波動(dòng)，空腹低血糖，餐后發(fā)生高血糖，被認(rèn)為患者是脆性糖尿病。經(jīng)過(guò)臨床住院治療，按脆性糖尿病進(jìn)行管理[2]，可血糖總是控制不好，卻忽略了糖尿病所致肝臟病變是罪魁禍?zhǔn)?。本研究通過(guò)對(duì)2007年3月～2012年10月期間所做的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和臨床觀察研究，進(jìn)一步證實(shí)這一理論，以便提供對(duì)糖尿病所致肝纖維化患者更好的血糖控制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動(dòng)物 6～8周齡體重160～180 g的健康雄性SD清潔級(jí)大鼠72只，購(gòu)于重慶醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，許可證號(hào)SYXK（渝）2006007。

1.1.2 試劑 TGF-β1試劑盒，購(gòu)自北京中杉生物技術(shù)有限公司。

1.2 方法

1.2.1 動(dòng)物模型的制備 按參考文獻(xiàn)[3]稍加修改建立模型。取SD大鼠36只禁食12 h后，按40 mg/kg左下腹腔注射STZ，制造DM模型。給予足夠的飲水，72 h后大鼠尾尖取血測(cè)空腹血糖，血糖≥7.0 mmol/L確定為DM成模大鼠，血糖≥18.0 mmol/L給予諾和靈N2-3 U皮下注射，以防糖尿病酮癥酸中毒死亡，共成模34只。將成模大鼠隨機(jī)分成3組：模型組1：11支、模型組2：11支、模型組3：12支，另取36只正常大鼠作為對(duì)照組，腹腔注射等量無(wú)菌檸檬酸鈉緩沖液，尾尖取血測(cè)空腹血糖，血糖在3.8～6.8 mmol/L。造模7 d后，正常組給予普通食物供給，模型組在正常食物基礎(chǔ)上加用高脂食物（20%熟豬油和3%膽固醇）。大鼠喂養(yǎng)條件為室溫18～20℃，相對(duì)濕度68%，12 h交替照明，大鼠自由飲水、進(jìn)食，對(duì)組1、2、3分別喂養(yǎng)8、12、16周。

1.2.2 取材與固定 相應(yīng)組大鼠在喂養(yǎng)8、12、16周后，每日取空腹及3餐后血糖記錄，以進(jìn)行比較，共3 d。后用2%戊巴比妥鈉40 mg/kg注入腹腔進(jìn)行麻醉，尾靜脈取血，分離血清，檢測(cè)血清學(xué)指標(biāo)。取肝組織適量，固定24 h，脫水，石蠟包埋，切片5 μm，用于免疫組織化學(xué)法檢測(cè)。

1.2.3 觀察指標(biāo) （1）一般狀況觀察；（2）肝纖維化指標(biāo)檢測(cè)；（3）各組大鼠空腹及餐后血糖的比較；（4）肝組織TGF-β1（轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1）免疫組化染色（三步法）。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

應(yīng)用SPSS12.0統(tǒng)計(jì)分析軟件處理，計(jì)量資料采用單因素方差分析，計(jì)量資料用（）表示，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 大鼠一般狀況表現(xiàn)

模型組大鼠活動(dòng)減少，毛發(fā)表現(xiàn)為不光滑并且比較粗糙，進(jìn)食已不如造模前，糞便變稀，有多尿、多飲，消瘦表現(xiàn)，精神倦怠。正常組大鼠活動(dòng)狀態(tài)佳，精神好，毛發(fā)光滑并且色澤好，進(jìn)食及大小便均無(wú)異常。

2.2 各組大鼠肝纖維化指標(biāo)的比較

各組大鼠肝纖維化指標(biāo)：透明質(zhì)酸（HA）、IV型膠原（IV-C）檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)表1。模型組HA、IV-C增高顯著，正常組HA、IV-C數(shù)值正常；兩組比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；模型組3與正常組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。

2.3 各組大鼠血糖的比較

正常各組中每一組空腹及餐后血糖處于正常范圍，而且波動(dòng)較小，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），見(jiàn)表2；模型組各組的空腹及餐后血糖均異常，空腹與餐后血糖波動(dòng)大，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；以模型組3波動(dòng)最大，其差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。隨著造模時(shí)間的延長(zhǎng)，血糖波動(dòng)越大，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.4 各組大鼠免疫組化TGF-β1表達(dá)

各組TGF-β1平均陽(yáng)性面積及平均吸光度（A）值比較。模型組陽(yáng)性面積和平均吸光度高于其他各組（P<0.05），模型組3與正常組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。見(jiàn)圖1、表3。

3 討論

世界衛(wèi)生組織發(fā)布的《2012年度世界衛(wèi)生統(tǒng)計(jì)報(bào)告》顯示，僅在2008年，全球約有3600萬(wàn)人死于非傳染疾病，約占當(dāng)年死亡人口總數(shù)的63%?！秷?bào)告》預(yù)計(jì)，到2030年，全球死于非傳染疾病的人口將增至5500萬(wàn)人。糖尿病等非傳染疾病愈發(fā)呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，中國(guó)成年糖尿病患者已逾9200萬(wàn)，已超過(guò)印度成為世界第一大糖尿病重災(zāi)區(qū)。糖尿病已經(jīng)成為中國(guó)最重要的非傳染性疾病[4]，嚴(yán)重威脅人類(lèi)健康。糖尿病有很多并發(fā)癥，而導(dǎo)致肝臟纖維化的病變也得到越來(lái)越多的重視[5-6]。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)TGF-β1在模型組中的表達(dá)明顯高于正常組。提示TGF-β1與糖尿病肝臟病變密切相關(guān)[7]。糖尿病肝纖維化的最主要病理改變是肝臟細(xì)胞脂肪變性、膠原纖維增生，細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）沉積最終導(dǎo)致彌漫性或結(jié)節(jié)性肝纖維化[8]。TGF-β1是目前最重要的促肝纖維化的活化因子之一，它可調(diào)節(jié)細(xì)胞外基質(zhì)受體的表達(dá)，刺激ECM的產(chǎn)生[9]，還通過(guò)抑制膠原酶和蛋白酶的產(chǎn)生，從而使ECM在肝臟大量沉積而導(dǎo)致肝纖維化，最終導(dǎo)致肝硬化的發(fā)生[10]。IV-C為構(gòu)成基底膜的主要成份，含量增高可較靈敏反映出肝纖維化過(guò)程，是肝纖維化的早期標(biāo)志之一。HA為基質(zhì)成分之一，由間質(zhì)細(xì)胞合成，可較準(zhǔn)確靈敏地反映肝內(nèi)已生成的纖維量及肝細(xì)胞受損狀況，在本實(shí)驗(yàn)中以上兩指標(biāo)均明顯升高，可見(jiàn)肝纖維化已經(jīng)發(fā)生。

近年來(lái)，糖尿病引起肝纖維化的報(bào)告逐年增多[11]，但糖尿病相關(guān)肝纖維化又惡性循環(huán)似的引起糖尿病患者的血糖波動(dòng)大[12]，不易控制，卻沒(méi)有引起足夠的重視，臨床中常見(jiàn)肝纖維化或者肝硬化患者空腹血糖正常甚至偏低，而餐后血糖卻異常增高[13]，即使使用胰島素也不易控制，反復(fù)調(diào)整胰島素的用量，劑量稍微大點(diǎn)低血糖就會(huì)發(fā)生，乃至低血糖昏迷，甚至誘發(fā)心血管并發(fā)癥，劑量小點(diǎn)，血糖又升高，糖尿病酮癥酸中毒又會(huì)出現(xiàn)?？墒桥R床上僅僅通過(guò)對(duì)肝功能的改善，也達(dá)到了對(duì)血糖的改善，血糖波動(dòng)小了，血糖穩(wěn)定了，并發(fā)癥明顯減少，因此在此提出重視糖尿病患者肝功能的保護(hù)，重視對(duì)糖尿病患者肝臟疾病的防治，減少并發(fā)癥，延長(zhǎng)壽命，是每一個(gè)醫(yī)務(wù)工作者的神圣使命。

[參考文獻(xiàn)]

[1] 唐小平，陳莊，陳麗麗，等.糖尿病相關(guān)肝纖維化研究進(jìn)展[J].重慶醫(yī)學(xué)，2011，40（22）：2270-2272.

[2] 徐晶晶，黃曉萍.住院脆性糖尿病患者的管理[J].實(shí)用臨床醫(yī)藥雜志，2010，14（22）：60-61.

[3] 李偉，張紅，殷松樓，等.不同劑量鏈脲佐菌素誘導(dǎo)SD大鼠糖尿病腎病模型的研究[J].徐州醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2006，26（1）：52-55.

[4] 潘長(zhǎng)玉.從循證醫(yī)學(xué)看糖尿病伴高血壓患者的血壓管理策略[J].中華內(nèi)分泌代謝雜志，2010，26（1）：1-5.

[5] Nathan DM，Buse JB，Davidson MB，et al.Medical management of hyperglycemia in type 2 diabetes：a consensus algorithm for the initiation and adjustment of therapy[J].Diabetes Care，2009，32（1）：193-203.

[6] Gnudi L，Thomas SM，Viberti G.Mechanical forces in diabetic kidney disease：a trigger for impaired glucose metabolism[J].J Am Soc Nephrol，2007，18（8）：2226-2232.

[7] Cheng K，Yang N，Mahato RI.TGF-betal gene silencing for treating liver fibrosis[J].Mol Pharm 2009，6（3），772-779.

[8] 齊會(huì)卿，安占軍，王富軍.糖尿病大鼠肝纖維化組織中MMP-1和TIMP-1的表達(dá)變化及意義[J].河北醫(yī)藥，2009，31（8）：901-903

[9] 張連峰，田笑笑，王春峰.轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子和基質(zhì)金屬蛋白酶組織抑制因子1在肝纖維化中的診斷及關(guān)系[J].中華肝臟病雜志，2007，15（4）：258-259.

[10] 褚云香.MMP-1、TIMP-1及其在肝纖維化中的作用[J].國(guó)際消化病雜志，2006，26：109-112.

[11] Nathan DM，Buse JB，Davidson MB，et al.Medical management of hyperglycemia in type 2 diabetes a consensus algorithm for the initiation and adjustment of therapy[J].Diabetes Care，2009，32（1）：193-203.

[12] 劉潔，王堯.血糖波動(dòng)與糖尿病并發(fā)癥的關(guān)系[J].現(xiàn)代醫(yī)學(xué)，2010，38（2）：200-203.

[13] 劉元周，周明輝，劉紅，等.肝硬化97例患者空腹血糖的臨床分析[J].中華醫(yī)學(xué)研究雜志，2003，12（3）：685-688.

（收稿日期：2013-01-15）