下向流曝氣生物濾池工藝處理藻漿壓濾液特性及微生物種屬分析

摘要：

對從太湖打撈的藍(lán)藻進(jìn)行離心脫水后獲得藻漿壓濾液，其中含有大量藻類細(xì)胞液，N、P以及微囊藻毒素（MCLR）含量較高，如不經(jīng)處理直接排放，必將引起二次污染。采用下向流曝氣生物濾池（BAF）工藝處理藻漿壓濾液，考察了對COD、氨氮、TN、TP、MCLR等污染物的去除效果。結(jié)果表明，當(dāng)水力負(fù)荷為0.40 m3/（m2·h）時，出水COD、氨氮、TN、TP、MCLR平均去除率分別為73.4%、91.6%、39.6%、13.2%和88.3%。出水COD、氨氮達(dá)到《城鎮(zhèn)污水處理廠污染物排放標(biāo)準(zhǔn)（GB 18918-2002）》中的一級A標(biāo)準(zhǔn)，MCLR低于《生活飲用水衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)（GB 5749-2006）》的限值。對BAF系統(tǒng)中微生物種屬進(jìn)行分析，通過構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹確定其優(yōu)勢菌種分別為賴氨酸桿菌、氣單胞菌、芽孢桿菌、不動桿菌、無色菌、梭狀桿菌和假單胞菌，啟動期投加的藻毒素降解菌T1在BAF系統(tǒng)中生長良好并形成優(yōu)勢菌種。

關(guān)鍵詞：

藻漿壓濾液；曝氣生物濾池；生物降解；DNA提?。痪N鑒定；系統(tǒng)發(fā)育

近20年來，由于水體富營養(yǎng)化導(dǎo)致湖泊和水庫水華頻發(fā)現(xiàn)象引起了公眾的關(guān)注?！叭敝坏奶w富營養(yǎng)化嚴(yán)重，幾乎每年夏季爆發(fā)藍(lán)藻水華。2007年太湖藍(lán)藻事件以來，環(huán)太湖沿岸地區(qū)已相繼建設(shè)了數(shù)十個藍(lán)藻集中打撈點和藻水分離站，在每年的4月初至10月底這段藍(lán)藻爆發(fā)期間運行，處理方法主要是先用吸藻船打撈出藍(lán)藻藻液并輸送至分離站，再經(jīng)氣浮后形成藻濃度更高的藻漿，藻漿經(jīng)加藥絮凝后離心脫水，脫水后的固體物為泥渣，液體稱之為壓濾液。這種藍(lán)藻打撈及藻漿壓濾處理的方法為中國太湖等少數(shù)藍(lán)藻爆發(fā)地區(qū)特有的應(yīng)急處理方法，國外未見報道，中國也未見藻漿壓濾液處理的報道。

張文藝，等：下向流曝氣生物濾池工藝處理藻漿壓濾液特性及微生物種屬分析

由于離心壓濾過程中大量藻細(xì)胞破損或死亡，使得藻細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)釋放到水體中，造成藻漿壓濾液含有高濃度的N、P以及微囊藻毒素（microcystins，MCs）[1]。N、P是引起水體富營養(yǎng)化的主要因素之一，微囊藻毒素具有強(qiáng)肝毒性[24]和“三致”效應(yīng)，這些污染物質(zhì)若不經(jīng)處理直接排放，會對周邊水體造成二次污染，藻水分離站對藍(lán)藻的分離處理也變成“去藻不去污”。

目前，對于藻漿壓濾液的研究還處于起步階段，未見相關(guān)研究報道。藻水分離站也僅進(jìn)行回流處理，污染物質(zhì)仍被間接排入水體，不能從根本上去除。因此，急需一種有效、快速的藻漿壓濾液的處理方法。下向流曝氣生物濾池（BAF）兼具物理過濾和生物降解作用，近年來在污水處理領(lǐng)域應(yīng)用較多。本試驗采用該工藝處理藻漿壓濾液，考察COD、氨氮、TN、TP以及MC的去除效果，對BAF系統(tǒng)內(nèi)生物膜進(jìn)行分離純化，分析其中的優(yōu)勢菌種，以期為藻漿壓濾液的有效處理提供技術(shù)參考。

1材料和方法

1.1試驗工藝流程

試驗工藝流程如圖1所示，下向流BAF試驗裝置有效體積1.68 L，有效高度1.0 m，內(nèi)徑46.79 mm。填料為經(jīng)NaCl改性的斜發(fā)沸石，沸石粒徑4～6 mm，孔隙率為52.47%。

圖1下向流BAF工藝流程示意圖

1.2試驗水質(zhì)

試驗用水為常州市武進(jìn)區(qū)藍(lán)藻污水處理站的藻漿壓濾液。為了保證良好的脫水效果，藻漿壓濾前加入了適量聚丙烯酰胺（PAM），故壓濾液中仍會殘留部分PAM，使壓濾液中藻類逐漸沉降，水質(zhì)變清。試驗水質(zhì)指標(biāo)如表1所示。

1.3BAF的啟動與運行

啟動：反應(yīng)器以0.15 m3/（m2·h）的濾速進(jìn)行自然掛膜。初期采用生活污水，7 d后改進(jìn)試驗用水。14 d后出水COD和氨氮去除率均大于70%且趨于穩(wěn)定，表明掛膜成功。

為了提高下向流BAF對壓濾液中藻毒素的生物降解能力，在掛膜進(jìn)水中加入1%的藻毒素降解菌菌液。菌液制備方法：將藻毒素降解菌接種于液體牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基，于30 ℃、100～120 r/min的條件下在恒溫?fù)u床中培養(yǎng)24～48 h。藻毒素降解菌（被命名為T1）是由張文藝等[5]從太湖底泥中篩選所得，保存在中國微生物菌種保藏管理委員會（登記入冊編號為：CGMCC4498）。

運行：運行期按水力負(fù)荷的遞增分為0.15、040、0.65、0.90 m3/（m2·h） 4個階段，每運行5 d反沖洗1次。采用氣水聯(lián)合反沖洗，方法是：先曝氣10 min，曝氣強(qiáng)度為40～50 m3/（m2·h）；再氣水聯(lián)合反沖洗10 min，進(jìn)水流速為15～20 m3/（m2·h）；然后停止曝氣，用水反沖洗10 min；在一定的水力負(fù)荷條件下穩(wěn)定24 h后進(jìn)行取樣測定。

1.4水質(zhì)分析方法

按中國國家標(biāo)準(zhǔn)法[6]：其中CODCr采用密閉消解法，氨氮采用蒸餾法，TN采用堿性過硫酸鉀消解分光光度法，TP采用鉬酸銨分光光度法。藻毒素（MCLR）的測定采用比克（Beacon，America）公司的微囊藻毒素檢測試劑盒（酶聯(lián)免疫法）。

1.5微生物的分離純化

待BAF穩(wěn)定運行時，從反應(yīng)器內(nèi)取出100 mL填料置于三角瓶中，加入100 mL無菌水，置于120 r/min的搖床中，30 min后將其靜置5 min，并吸取上清液10 mL于100 mL液體培養(yǎng)基中，于30 ℃搖床轉(zhuǎn)速120 r/min下富集培養(yǎng)24 h。將富集培養(yǎng)后的菌液用無菌水進(jìn)行倍比稀釋，吸取100 μL稀釋后的菌液至NB固體培養(yǎng)基，平板涂布后于30 ℃恒溫生化培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。24～48 h后，進(jìn)行菌落形態(tài)特征觀察，選擇性地分別挑選單一菌落進(jìn)行平板劃線，重復(fù)劃線2～3次，獲得純化的單一菌株。

NB培養(yǎng)基配方：牛肉膏3 g、蛋白胨10 g、NaCl 5 g、瓊脂15～20 g（僅配制固體培養(yǎng)基時加入）、蒸餾水1 000 mL、pH 7.0～7.2。滅菌條件：121 ℃，103 kPa，20 min。

1.6細(xì)菌計數(shù)

BAF運行穩(wěn)定時，從反應(yīng)器內(nèi)取出100 mL填料于三角瓶中，加入100 mL無菌水，置于120 r/min的搖床中，30 min后吸取10 mL作為檢測水樣進(jìn)行倍比稀釋直至10-8。吸取不同稀釋倍數(shù)的水樣1 mL至無菌培養(yǎng)皿，在每個培養(yǎng)皿中倒入冷卻至50 ℃左右的NB培養(yǎng)基20 mL，迅速轉(zhuǎn)動培養(yǎng)皿使之混勻，置水平位置靜止后使之凝固，倒置后于30 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，選取適宜的稀釋倍數(shù)下的平板進(jìn)行菌落計數(shù)，同一稀釋倍數(shù)計數(shù)3個取平均值。

1.7DNA提取及同源性分析

DNA提取采用上海捷瑞生物工程有限公司的細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒（離心柱型），菌種鑒定采用16S rDNA序列分析法。PCR正向引物為5-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3，反向引物為5-CTACGGTTACCTTGTTACGAC-3，體系50.0 μL（25.0 μL 2倍濃度含染料Taq Master Mix，10 μL正向引物，10 μL反向引物，1.0 μL DNA模板，22.0 μL雙蒸水）。反應(yīng)條件為：預(yù)變性94 ℃，5 min；變性94 ℃，45 s；退火56 ℃，45 s；延伸72 ℃，1 min 50 s；最后延伸72 ℃，10 min；循環(huán)30次。

DNA的測序工作委托南京昆泰生物科技有限公司完成，測序結(jié)果通過DNAMAN軟件進(jìn)行拼接并去除載體序列的影響，將獲得的16S rDNA菌株序列在NCBI（美國國家生物技術(shù)信息中心，http：//www. ncbi.nlm.nih.gov/BLAST）網(wǎng)上進(jìn)行BLAST，與GenBank數(shù)據(jù)庫中的16S rDNA基因序列進(jìn)行同源性比較分析。使用MEGA 5.0軟件采用鄰位連接法（Neighbour Joining）繪制系統(tǒng)發(fā)育樹，各分枝的重復(fù)性采用Bootstrap method程序分析，重復(fù)數(shù)為1 000，根據(jù)菌株的16S rDNA序列在系統(tǒng)發(fā)育樹中的地位判斷其分類歸屬。

2結(jié)果與分析

2.1COD去除效果

圖2為水力負(fù)荷分別為0.15、0.40、0.65、0.90 m3/（m2·h） 4個階段的COD去除效果。廢水生物處理過程中，由于水溫、溶解氧（DO）及進(jìn)水COD波動，BAF出水指標(biāo)總有少量波動；同一水力負(fù)荷下，COD去除率通常有10%左右的波動。為避免這種情況對分析造成的影響，取5組數(shù)據(jù)的平均去除率進(jìn)行分析，以消除這種波動。由該圖可見，隨著水力負(fù)荷的增加，COD的去除率總體呈下降的趨勢。水力負(fù)荷從0.15 m3/（m2·h）增加為0.40 m3/（m2·h）時，平均去除率由77.13%降至73.39%；再增加至0.65 m3/（m2·h）時，去除率基本保持持平；增加至0.90 m3/（m2·h）時，去除率降為63.88%。水力負(fù)荷為0.15～0.90 m3/（m2·h）時，出水均能達(dá)到《城鎮(zhèn)污水處理廠污染物排放標(biāo)準(zhǔn)（GB 18918-2002）》一級A標(biāo)準(zhǔn)（≤50 mg/L）。水中CODCr的去除主要依賴物理截留和微生物的分解作用。本試驗中CODCr去除率下降主要是因為隨著水力負(fù)荷的增大，污水與BAF中微生物接觸的時間縮短，水中有機(jī)物被降解的機(jī)率減??；另外，流速增大使得水對生物膜的沖擊力增大，生物膜易脫落，影響出水COD值。

圖2水力負(fù)荷對COD去除的影響

2.2氨氮去除分析

圖3為水力負(fù)荷分別為015、040、065、090 m3/（m2·h） 4個階段的氨氮去除效果。由該圖可見，水力負(fù)荷在0.15～0.90 m3/（m2·h）范圍內(nèi)時，BAF反應(yīng)器對氨氮都有比較好的去除效果，去除率均大于80%。水力負(fù)荷為0.15～0.65 m3/（m2·h）時，去除率相差不大，平均去除率為91.6%；水力負(fù)荷提高至0.90 m3/（m2·h）時，去除率輕微下降至835%。水力負(fù)荷為0.15～0.65 m3/（m2·h）時，出水氨氮能達(dá)到《城鎮(zhèn)污水處理廠污染物排放標(biāo)準(zhǔn)（GB 18918-2002）》一級A標(biāo)準(zhǔn)（≤5 mg/L）。

圖3水力負(fù)荷對氨氮去除的影響

下向流BAF對藻漿壓濾液中氨氮的去除機(jī)理主要表現(xiàn)在如下3個方面：1）某些微生物如芽孢桿菌[7]，通過合成代謝將氨氮轉(zhuǎn)化為自身細(xì)胞成分從而減少水中的氨氮含量；2）氨氮在硝化細(xì)菌的作用下轉(zhuǎn)化為NO2-、NO3-；3）BAF填料—NaCl改性沸石對氨氮有物理吸附和離子交換的作用[810]。

2.3總氮去除分析

圖4為水力負(fù)荷分別為0.15、0.40、0.65、0.90 m3/（m2·h） 4個階段的總氮去除效果。由該圖可見，總氮的去除率呈先上升后下降的趨勢。水力負(fù)荷040 m3/（m2·h）時，平均去除率最高，為39.6%。分析認(rèn)為，水力負(fù)荷0.15 m3/（m2·h）時，一方面，水力負(fù)荷低時，產(chǎn)生的NO2-和NO3-濃度就高，NO2-抑制了好氧反硝化細(xì)菌的活性，降低了對NO3-的轉(zhuǎn)化；另一方面，雖然污染物與微生物的接觸時間較長，但氣、水的傳質(zhì)速率受到影響，不利于總氮的去除；水力負(fù)荷大于0.40 m3/（m2·h）后，氣、水的傳質(zhì)速率已不再是影響總氮去除的因素，而由于與微生物的接觸時間縮短，去除率一直減小。

去除總氮主要有3個途徑：1）氮被填料表面微生物轉(zhuǎn)化為自身組成成分后隨著反沖洗水排出；2）BAF反應(yīng)器具有同步反硝化作用[1113]，在反硝化菌的作用下NO2-和NO3-被轉(zhuǎn)化成N2釋放到空氣中；3）NaCl改性沸石對氮的物理吸附和離子交換作用。BAF反應(yīng)器對總氮的去除率并不高，主要是缺少缺氧的環(huán)境，導(dǎo)致反硝化作用效率低，對此可增加一級BAF，為反硝化反應(yīng)提供缺氧的環(huán)境。

圖4BAF連續(xù)運行對TN的處理效果

2.4總磷的去除分析

圖5為不同水力負(fù)荷條件下總磷的去除效果。由該圖可見，隨著水力負(fù)荷的上升，總磷的去除率一直下降，4個階段的去除率分別為16.5%、13.2%、9.2%、6.6%?？偭兹コ氏陆档闹饕蚴撬ω?fù)荷增加導(dǎo)致與微生物接觸的時間縮短。

圖5BAF連續(xù)運行對TP的處理效果

下向流BAF對藻漿壓濾液中TP的去除率較低，主要是由于BAF反應(yīng)器的結(jié)構(gòu)比較簡單，不能滿足生物除磷通常需要的厭氧、好氧交替進(jìn)行的運行條件，其工作原理主要是好氧生物氧化和物理截留，故BAF反應(yīng)器難以取得理想的生物除磷效果[14]。對此，可以在系統(tǒng)前增加厭氧反應(yīng)池，以便聚磷菌在后續(xù)好氧段大量吸收磷，提高總磷去除率。

2.5藻毒素去除分析

藻毒素包括胞內(nèi)藻毒素和胞外藻毒素。胞內(nèi)藻毒素主要存在于藻細(xì)胞內(nèi)，若將藻類去除，胞內(nèi)藻毒素也隨之去除，而胞外藻毒素的去除主要依靠微生物降解。圖6為不同水力負(fù)荷條件下對藻毒素MCLR的檢測結(jié)果。由圖可見，隨著水力負(fù)荷的增加，出水MCLR逐漸增大，其去除率逐漸降低。水力負(fù)荷增加到0.40 m3/（m2·h） 時，MCLR去除率略有降低，增加到0.65 m3/（m2·h）時，去除率降低明顯，再增加到0.90 m3/（m2·h）時，去除率降低幅度減小。由試驗結(jié)果得出，出水MCLR濃度低于世界衛(wèi)生組織頒布的《飲用水衛(wèi)生準(zhǔn)則》和中國《生活飲用水衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)（GB 5749-2006）》的限值（1.0 μg/L）。

圖6水力負(fù)荷MCLR去除的影響

試驗中BAF反應(yīng)器對MCLR有較好的去除效果，主要因為：1）由于濾料的過濾作用，藻細(xì)胞被攔截，由此便去除了大部分胞內(nèi)藻毒素；2）改性沸石可能存在對藻毒素的吸附作用；3）所投加的MC降解菌以及反應(yīng)器內(nèi)某些微生物對藻毒素的生物降解作用，這是胞外藻毒素降解的主要機(jī)制。

本試驗所投加的MC降解菌T1為張文藝等[5]從太湖底泥中篩得。研究表明，T1對初始濃度為250 μg/L的MCLR的去除率可達(dá)60%～70%。而本試驗中MCLR的濃度較低，為2.5 μg/L左右，且污水成分復(fù)雜，微生物可利用的碳源除MCLR外還有很多，在與多種碳源共存的條件下，MCLR的去除率仍達(dá)到75%左右，這說明T1對藻毒素的降解具有一定的專一性，不會因為其他碳源的存在而影響其對MCLR的利用。這一現(xiàn)象也說明了T1具有開發(fā)工程菌的價值，即用于處理成分復(fù)雜的實際污水時也可保持與靜態(tài)實驗相當(dāng)?shù)男Ч?/p>

2.6微生物分離結(jié)果

經(jīng)過分離純化，共分得15株菌株，其中革蘭氏陽性菌5株，陰性菌10株，對它們純培養(yǎng)得到的菌落形態(tài)特征及革蘭氏染色結(jié)果總結(jié)于表2。

2.7細(xì)菌計數(shù)結(jié)果

每毫升生物膜震蕩混合液中各菌數(shù)量見表2，各菌數(shù)量由多到少依次是：1#、3#、7#、5#、6#、2#、4#、9#、8#、10#、12#、15#、13#、14#和11#。其中1#～7#的數(shù)量均多于其他菌類，它們在下向流BAF處理藻漿壓濾液系統(tǒng)中占優(yōu)勢，為它們分別編號為BL1～BL7，作為進(jìn)一步研究的對象。

2.8優(yōu)勢菌DNA鑒定

對BL1～BL7進(jìn)行DNA提取和測序，將序列提交到GenBank數(shù)據(jù)庫，獲得BL1～BL7登錄號分別為JQ923439、JQ923440、JQ923441、JQ923442、JQ923443、JQ923444、JQ923445。將序列在GenBank中進(jìn)行BLAST，與已知的有代表性序列進(jìn)行比對，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，結(jié)果如圖7所示。

圖7BAF系統(tǒng)中7株優(yōu)勢菌的16S rDNA序列與GenBank中最相似序列的系統(tǒng)進(jìn)化樹

同源性分析和系統(tǒng)進(jìn)化表明，BL1與Lysinibacillus sphaericus（球形賴氨酸桿菌）最為相似；BL2與Bacillus fusiformis（梭狀桿菌）、BL3與Aeromonas veronii（維氏氣單胞菌）、BL4與Pseudomonas putida（惡臭假單胞菌）、BL5與Acinetobacter calcoaceticus（醋酸鈣不動桿菌）、BL6與Achromobacter xylosoxidans（木糖氧化無色桿菌）、BL7與Lysinibacillus sphaericus（球形賴氨酸桿菌）最相似。結(jié)合菌株的形態(tài)學(xué)和生理學(xué)特性，初步鑒定BL1為賴氨酸桿菌屬，BL2為梭狀桿菌屬，BL3為氣單胞菌屬，BL4為假單胞菌屬，BL5為不動桿菌屬，BL6為無色菌屬，BL7為芽孢桿菌屬。其中，BL1、BL2、BL7三株菌的親緣關(guān)系較近。

根據(jù)細(xì)菌計數(shù)結(jié)果，BAF反應(yīng)器內(nèi)BL1～BL7數(shù)量由多到少依次是：BL1、BL3、BL7、BL5、BL6、BL2和BL4?？梢夿AF反應(yīng)器中占優(yōu)勢菌類依次為賴氨酸桿菌、氣單胞菌、芽孢桿菌、不動桿菌、無色菌、梭狀桿菌和假單胞菌。其中，BL7與所投加的藻毒素降解菌T1（登錄號HQ877618.1）的相似性為99%，且同為芽孢桿菌屬。根據(jù)進(jìn)化樹種的親緣關(guān)系，基本可以確定BL7與T1為同一種菌，即為T1后代。由此從遺傳學(xué)的角度證實了T1菌在BAF反應(yīng)器內(nèi)生長良好并形成了一定的優(yōu)勢。

3結(jié)論

1）下向流BAF處理藻漿壓濾液的最佳的水力負(fù)荷為0.40 m3/（m2·h）。此條件下出水CODCr、氨氮、TN、TP、MCLR平均去除率分別為734%、91.6%、39.6%、13.2%和88.3%。出水COD、氨氮達(dá)到《城鎮(zhèn)污水處理廠污染物排放標(biāo)準(zhǔn)（GB 18918-2002）》中的一級A標(biāo)準(zhǔn)，TP基本滿足《城鎮(zhèn)污水處理廠污染物排放標(biāo)準(zhǔn)（GB 18918-2002）》三級標(biāo)準(zhǔn)，MCLR低于《生活飲用水衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)（GB 5749-2006）》的限值。

2）通過分離純化，從下向流BAF反應(yīng)器中共獲得15株菌株，分別命名為BL1～BL15，其中BL1～BL7為優(yōu)勢菌株，通過DNA提取、PCR擴(kuò)增、測序和構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，確定其種屬分別為芽孢桿菌、梭狀桿菌、氣單胞菌、假單胞菌、不動桿菌、無色菌和芽孢桿菌。

3）通過菌種數(shù)量統(tǒng)計和菌種鑒定表明，啟動期投加的藻毒素降解菌T1菌在BAF反應(yīng)器內(nèi)生長良好并形成了優(yōu)勢菌種。

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