重組人細(xì)胞外基質(zhì)磷酸化糖蛋白對人牙髓細(xì)胞體外礦化的影響

艾林　王慧媛　霍麗　李明勇

[摘要]目的：探討細(xì)胞外基質(zhì)磷酸化糖蛋白（Matrix extracellular phosphoglycoprotein，MEPE）對人牙髓細(xì)胞（human dental pulp cells，HDPCs）在體外的礦化能力的影響，從而了解該蛋白在牙齒生長發(fā)育過程中的作用。方法：常規(guī)方法培養(yǎng)獲得人牙髓細(xì)胞，實(shí)驗(yàn)組中使用的MEPEs的濃度為100μg/L。通過Von kossa染色觀察MEPE對人牙髓細(xì)胞礦化的影響。結(jié)果：MEPE蛋白能促進(jìn)人牙髓細(xì)胞的礦化。結(jié)論：MEPE具有促進(jìn)人牙髓細(xì)胞的礦化的能力，可能在牙齒生長發(fā)育過程中起著重要的作用。

[關(guān)鍵詞]牙髓細(xì)胞；礦化；細(xì)胞外基質(zhì)磷酸化糖蛋白

[中圖分類號]Q813.1 Q591.2 [文獻(xiàn)標(biāo)識碼]A [文章編號]1008-6455（2013）05-0542-03

這些年來， 牙髓生物學(xué)已變?yōu)榭谇粌?nèi)科學(xué)研究領(lǐng)域的重點(diǎn)和熱點(diǎn)。在牙髓生物學(xué)的研究過程中人牙髓細(xì)胞是其中最重要細(xì)胞來源，這是因?yàn)槿搜浪杓?xì)胞容易獲取，并且容易在體外培養(yǎng)擴(kuò)增，同時(shí)具有成骨能力確切以及多向分化潛能的優(yōu)點(diǎn)。骨組織和成牙本質(zhì)細(xì)胞中可以表達(dá)細(xì)胞外基質(zhì)磷酸化糖蛋白（Matrix extracellular phosphoglycopro tein，MEPE）。成牙本質(zhì)細(xì)胞分泌的MEPE，可以運(yùn)至細(xì)胞外基質(zhì)中，可能在牙髓細(xì)胞的分化以及牙髓牙周組織的礦化過程中發(fā)揮重要作用。目前關(guān)于MEPE蛋白的確切功能還沒有明確結(jié)論，而MEPE蛋白的生物學(xué)功能可以通過組織表達(dá)的特點(diǎn)進(jìn)行研究。本實(shí)驗(yàn)擬通過細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)，組織化學(xué)，體外礦化實(shí)驗(yàn)等方法，研究MEPE在牙髓生理反應(yīng)中的作用機(jī)制，同時(shí)觀察MEPE對體外培養(yǎng)的人牙髓細(xì)胞礦化能力的影響， 為臨床應(yīng)用MEPE提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 主要材料和儀器：重組人MEPE蛋白；兔SP Kit（上海生工公司，中國）；噻唑鹽（GIBCO，美國）；DMEM培養(yǎng)液（AMERSCO，美國）；牛血清白蛋白（BSA）（北京中山生物技術(shù)有限公司，中國）；胎牛血清（FBS）（GIBCO，加拿大）；倒置、相差顯微鏡（Nikon，日本）；CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱（北京中山生物技術(shù)有限公司，中國）。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 人牙髓細(xì)胞的體外培養(yǎng)：選擇12～18歲因正畸需要拔除的恒牙。拔除后在無菌條件下分離牙髓組織，放置于含鏈霉素、青霉素、兩性霉素 B （濃度均為10mg/L）的 PBS 溶液里。在PBS溶液中浸泡3次，每次5min。然后把牙髓組織剪切成1mm大小的碎塊，把組織塊平鋪在含有Ⅰ型膠原的25cm DMEM培養(yǎng)瓶里，其中每瓶約含30塊牙髓組織塊。把含有牙髓組織塊的DMEM培養(yǎng)瓶在CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱（37℃，5% CO2）中培養(yǎng)。當(dāng)觀察到原代培養(yǎng)組織細(xì)胞塊周圍長出細(xì)胞后，使用倒置顯微鏡觀察組織貼壁的情況。培養(yǎng)過程中每周換液至少1次，當(dāng)細(xì)胞長滿2/3瓶時(shí)，使用0.01 %EDTA 和0.25 %胰酶的混合溶液，以1∶1進(jìn)行消化，并且按 1∶2 進(jìn)行傳代培養(yǎng)。傳到第6代作細(xì)胞學(xué)檢測。

1.2.2 MEPE的配制及分組：用PBS緩沖液將MEPE凍干粉配成1g/L的溶液，再將濃度稀釋為100μg/L進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.2.3 Von kossa染色：實(shí)驗(yàn)分組放置于96孔培養(yǎng)板內(nèi)，將傳代培養(yǎng)人牙髓細(xì)胞以1×106/cm2濃度接種于培養(yǎng)板內(nèi)，每孔加入0.5ml。DMEM培養(yǎng)液中含φ=10%FCS、50μg/ml L-抗壞血酸10μmol/L β-磷酸甘油。φ（CO2）=5%、飽和濕度37℃環(huán)境下培養(yǎng)。每3天更換培養(yǎng)液，培養(yǎng)至第28天，吸除培養(yǎng)液，PBS漂洗3遍。加入40g/L多聚甲醛，4℃低溫下固定24h。采用Von kossa法進(jìn)行鈣鹽沉積染色。吸除固定液，PBS振洗3次，每次5min。將培養(yǎng)板浸沒于50g/L硝酸銀溶液中，室溫下浸泡2h。取出后蒸餾水反復(fù)沖洗3遍。浸入30g/L硫代硫酸鈉溶液中浸泡5min，取出后充分水洗，蒸餾水漂洗3遍。滴入10g/L中性紅襯染1min。酒精脫水，二甲苯透明，封固，鏡檢。

2 結(jié)果

2.1 人牙髓細(xì)胞的生長：使用倒置相差顯微鏡觀察，在接種兩天后，牙髓細(xì)胞開始貼壁， 這時(shí)出現(xiàn)大量增殖， 第6天可見大量克隆細(xì)胞，細(xì)胞表面及四周有大量紅細(xì)胞。換去全部液體，洗去大部分紅細(xì)胞，鏡下貼壁細(xì)胞成不規(guī)則三角形或紡錘形，成纖維細(xì)胞集落樣方式生長， 并且可以觀察到長短不同的突起（圖1），證明人牙髓細(xì)胞培養(yǎng)成功。

2.2 Von kossa染色結(jié)果見圖2。

3 討論

牙本質(zhì)是重要的牙體組織，它具有一些重要的生理功能，是構(gòu)成牙齒的主體，也承擔(dān)著感覺、修復(fù)等重要作用。生物礦化是目前口腔醫(yī)學(xué)研究的的重點(diǎn)和熱點(diǎn)，這項(xiàng)研究可以闡明牙齒的形成，了解牙體牙髓損傷修復(fù)的機(jī)制以及指導(dǎo)齲病的臨床治療。目前普遍認(rèn)為細(xì)胞外基質(zhì)蛋白在此過程中起到重要的作用。

MEPE，又稱成骨細(xì)胞或骨細(xì)胞因子45（Osteoblast/Osteocyte Factor 45；OF45）被歸為 SIBLING （Small Integrin-Binding LIgand，N-linked Glycoprotein）家族。MEPE與骨橋素（osteopontin，OPN），釉蛋白（enamelin，ENAM）等在基因水平和蛋白質(zhì)水平的結(jié)構(gòu)以及功能等多方面具有相當(dāng)多的相似之處。 2000年，Rowe等[1]發(fā)現(xiàn)了MEPE，該研究組進(jìn)行RT-PCR腫瘤性低血磷性骨軟化癥（oncogenic hypophosphatemic osteomalacia，OHO）患者腫瘤組織的cDNA文庫，發(fā)現(xiàn)文庫的基因檢測表達(dá)上調(diào)，該研究組發(fā)現(xiàn)MEPE可以在骨髓和大腦中表達(dá)，然而在腎、肺以及胎盤等組織中的表達(dá)水平比較低。Petersen等[2]在成骨細(xì)胞中克隆到MEPE基因，該研究組進(jìn)行了組織免疫化學(xué)以及Northern blot等研究，其結(jié)果顯示：MEPE在皮質(zhì)骨和骨小梁中的骨細(xì)胞出現(xiàn)高表達(dá)，而且只表達(dá)在骨組織中。Heinrich等[3]發(fā)現(xiàn)MEPE不僅在骨細(xì)胞表達(dá)而且也可以在成骨細(xì)胞中表達(dá)。

MEPE在口腔醫(yī)學(xué)研究方面的論著很少。有學(xué)者[4]認(rèn)為MEPE可以在成牙本質(zhì)細(xì)胞中表達(dá)，是牙本質(zhì)發(fā)育異常性疾病的重要候選基因，該研究組發(fā)現(xiàn)MEPE與II型牙本質(zhì)發(fā)育不良以及II牙本質(zhì)發(fā)育不全等疾病的病因相關(guān)。有學(xué)者將MEPE植于大鼠牙髓腔中，一個(gè)月天后鏡下可見形成大量修復(fù)性牙本質(zhì)，結(jié)果顯示MEPE可能可以促進(jìn)牙髓細(xì)胞分化成為成牙本質(zhì)細(xì)胞[5]。

在組織生長發(fā)育過程中，細(xì)胞外基質(zhì)蛋白作為一種必需的信號分子，是細(xì)胞分化和附著的底物，其提供細(xì)胞生長的信號，控制細(xì)胞的附著并且為組織和細(xì)胞提供機(jī)械支持作用，細(xì)胞的生長和功能也受細(xì)胞外基質(zhì)的影響。因此，細(xì)胞外基質(zhì)是細(xì)胞進(jìn)行增殖、遷移和分化的前提[6-9]。本實(shí)驗(yàn)通過Von kossa染色觀察MEPE對人牙髓細(xì)胞礦化的影響，發(fā)現(xiàn)MEPE蛋白可以促進(jìn)人牙髓細(xì)胞的礦化，也就意味著MEPE蛋白在牙齒生長發(fā)育過程中起著重要的作用。本實(shí)驗(yàn)初步探討了MEPE蛋白對人牙髓細(xì)胞礦化能力的影響，但是關(guān)于MEPE的分子機(jī)理研究還需不斷深入。

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[收稿日期]2013-01-22 [修回日期]2013-03-21

編輯/張惠娟