超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法快速測定沉積物中11種藻毒素

趙 彬，王 昭，張 敏*，張付海，田丙正，丁 磊

(1.安徽省環(huán)境監(jiān)測中心站，安徽 合肥 230071；2.安徽省出入境檢驗檢疫局 檢驗檢疫技術中心，安徽 合肥 230031)

超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法快速測定沉積物中11種藻毒素

趙 彬1，王 昭2，張 敏1*，張付海1，田丙正1，丁 磊2

(1.安徽省環(huán)境監(jiān)測中心站，安徽 合肥 230071；2.安徽省出入境檢驗檢疫局 檢驗檢疫技術中心，安徽 合肥 230031)

建立了超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(UPLC-MS/MS)快速測定沉積物中11種藻毒素的方法。沉積物經(jīng)冷凍干燥、粉碎過篩，用0.1 mol/L EDTA-Na4P2O7溶液渦旋超聲提取，經(jīng)HLB固相萃取小柱凈化后，用甲醇-0.2%甲酸洗脫、濃縮并氮吹定容至1 mL。經(jīng)Waters BEH C18色譜小柱，以乙腈-0.2%甲酸水溶液為流動相，梯度洗脫分離后，在電噴霧正離子模式下，以超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜多級監(jiān)測模式(MRM)外標法進行定性定量分析。結果表明：沉積物中11種藻毒素的檢出限為1.0～5.0 ng/kg。對同一環(huán)境樣品進行了0.1、1.0、4.0 μg/kg不同水平的加標回收試驗，平均回收率為70.3%～112.5%，相對標準偏差(RSD)為2.2%～9.3%。該方法快速、靈敏、準確，可應用于沉積物中11種藻毒素的快速監(jiān)測。

沉積物；藻毒素；超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜

藻毒素是藍藻產(chǎn)生的毒性很強的天然毒素。藻毒素可分為兩大類：一類具有急性致死作用，主要包括神經(jīng)毒素(Neurotoxins)和肝毒素(Hepatotoxins)；另一類對動物無較強致死毒性，但具有較高的特異生物活性，如細胞毒素(Cytotoxins)。神經(jīng)毒素和肝毒素的危害最大，文獻中對二者的報道最多[1]。微囊藻毒素(Microcystins，MCs)、節(jié)球藻毒素(Nodularins，NOD)、擬柱胞藻毒素 (Cylindrospermospins，CYN)是分布最為廣泛的3種毒素。其中微囊藻毒素和節(jié)球藻毒素屬于肝毒素，其主要靶器官為肝臟。微囊藻毒素是由微囊藻產(chǎn)生的對蛋白磷酸酶PP1和PP2A具有抑制性的環(huán)狀七肽，目前已知的種類有90多種。節(jié)球藻毒素主要由泡沫節(jié)球藻(Nodulariaspumigena)產(chǎn)生，其結構與微囊藻毒素類似，是一種環(huán)狀五肽結構，可抑制蛋白磷酸酶PP1和PP2A的活性。擬柱胞藻毒素的分子式為C15H21N5O7S，分子量為415.4，易溶于水、甲醇、二甲亞砜，是具有細胞毒性、肝毒性、神經(jīng)毒性和遺傳毒性的生物堿毒素，可通過抑制蛋白質(zhì)合成而導致腸胃炎、肝損傷、腎損傷、腸損傷，危及人體健康。近年來隨著人們生活水平的提高和工農(nóng)業(yè)活動的發(fā)展，水體富營養(yǎng)化現(xiàn)象日趨普遍，世界上淡水湖泊藍藻爆發(fā)的頻率也不斷增加[2-4]。

巢湖是我國第五大淡水湖，每年藍藻不時爆發(fā)，一直備受關注。在實際治理過程中，藍藻在水華時常被攔截、打撈作為有機肥施入農(nóng)田，或堆放在湖岸邊沉降到湖底。而藻細胞破裂釋放高濃度的藻毒素會嚴重污染沉積物，會危害相關水生生物的生長和相關水產(chǎn)品的安全，進而通過食物鏈對人體健康產(chǎn)生危害[5]。與水體環(huán)境相比，沉積物由于基質(zhì)更加復雜，樣品采集及處理過程更加繁瑣，其藻毒素的監(jiān)測方法鮮有研究和報道[6]。因此，建立快速、準確、靈敏可靠的沉積物中藻毒素的測定方法顯得尤為重要。

目前該類化合物的測定只針對微囊藻毒素類、節(jié)球藻毒素或者擬柱胞藻毒素分別進行，其檢測方法主要有生物化學法、酶聯(lián)免疫檢測法、高效液相色譜法和液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用法等[7-13]，尚未見使用一種方法對該3種毒素進行同時檢測的報道。生物化學法選擇性較差，靈敏度不夠，只能測定毒素總量，無法分別測定不同種類毒素含量。酶聯(lián)免疫法假陽性幾率大，且重現(xiàn)性差。液相色譜法則由于環(huán)境水樣基質(zhì)復雜，背景干擾多等特點，不易定性，且易出現(xiàn)假陽性。而液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法則能更好地應對基質(zhì)復雜，有背景干擾的樣品監(jiān)測要求。針對基質(zhì)復雜、含水率較高的環(huán)境樣品的前處理方法主要有液-液萃取、加速溶劑萃取(ASE)、固相小柱凈化(SPE)和滲透凝膠色譜凈化(GPC)等。本文在前期研究的基礎上[14-15]，建立了同步提取、同時測定沉積物中11種藻毒素的超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜快速檢測方法。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

真空冷凍干燥機(LGJ-25，北京四環(huán)科學儀器)；臺式鄂式破碎儀(JC6，北京格瑞德曼)；Waters TQ-S超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(Waters公司，美國)；Masslynx 4.1工作站；固相萃取柱C18、HLB(6 mL/500 mg，Waters公司)；定量平行濃縮儀(MultiVap-8，北京萊伯泰科)；超純水制備儀(Millipore Milli-Q Integral15，美國)；色譜柱：Waters BEH C18(50 mm×2.1 mm，i.d.，1.7 μm)。

11種藻毒素標準品購于瑞士ENZO@Life Sciences公司，100 μg，純度≥95.0%(化合物信息詳見表1)，甲酸、甲醇、乙腈(農(nóng)殘級，Merk公司)；超純水；0.22 μm有機濾頭。

1.2 樣品的采集與制備

采集2 kg沉積物于棕色光口玻璃瓶中，4 ℃冷藏保存。樣品經(jīng)真空冷凍干燥后，研磨粉碎過0.24 mm孔徑篩。

1.3 樣品前處理

1.3.1樣品提取準確稱取10.00 g上述制備好的樣品于100 mL離心管中，分3次加入100 mL 0.1 mol/L EDTA-Na4P2O7溶液，渦旋混勻后超聲萃取20 min。然后以8 000 r/min離心10 min，合并收集提取液，待凈化。

1.3.2固相萃取小柱凈化用5 mL甲醇、10 mL水活化HLB固相萃取柱，保證小柱柱頭浸潤。將上述提取液以小于5 mL/min 的流速通過小柱富集，再用10 mL水淋洗，將小柱上保留較弱的雜質(zhì)淋洗下來。用氮氣吹掃小柱5 min，將小柱中的殘留水分完全去除。再用15 mL甲醇-0.2%甲酸水溶液(體積比9∶1)洗脫富集后的小柱，洗脫液收集于接收管中。將上述洗脫液氮吹濃縮至近干，加入甲醇-0.2%甲酸水溶液(1∶4)定容至1.0 mL，混勻后過0.22 μm濾膜，待測。

1.4 色譜質(zhì)譜條件

色譜條件：流動相：A為乙腈，B為0.2%甲酸-水。采用線性梯度洗脫條件:0～0.5 min，75%B；0.5～4.5 min，75%～45%B； 4.5～5.0 min，45%～5%B；5.0～6.0 min，5%B;6.0～6.5 min，5%～75%B；6.5～7.0 min，75%B。進樣量為10 μL。流速：0.4 mL/min。樣品室溫度：10 ℃；色譜柱溫：40 ℃。

質(zhì)譜條件：采用電噴霧離子源(ESI)正離子模式進行檢測，多級反應監(jiān)測模式(MRM)。噴射電壓1.5 kV，源溫度為150 ℃，脫溶劑氣溫度為450 ℃，流量為800 L/h，錐孔氣流速為150 L/h，錐孔電壓和碰撞能量見表1。

表1 11種藻毒素的名稱、CAS號、分子量和MRM分析條件Table 1 The names，CAS numbers，molecular weight and MRM analysis conditions of 11 kinds of algal toxins

*quantitative ion

2 結果與討論

2.1 樣品前處理條件的優(yōu)化

2.1.1樣品前處理方法的選擇目前關于環(huán)境沉積物樣品的前處理大都采用風干干燥的方法，但該法由于需大量時間而可能導致目標物的降解損失。因此本實驗選擇真空冷凍干燥法，可以快速對含水率較高的沉積物進行干燥。

對于干燥研磨好的樣品，目前的提取方法大多為液-液萃取、超聲萃取和加速溶劑萃取(ASE)等。本文參考文獻方法[6]，超聲提取20 min，能夠更加快速并充分提取目標化合物，11種藻毒素的提取回收率為68.6%～109.1%，相比較文獻報道[6]的54.9%～97.4%，回收率提高了12%～25%。

環(huán)境樣品基質(zhì)復雜，背景干擾物多，目前常用的凈化方法有固相小柱萃取法(SPE)、凝膠滲透色譜法(GPC)、基質(zhì)解析法等。由于這11種藻毒素為極易溶于水、難溶于有機溶劑的多肽類化合物，故不宜選用以有機溶劑為流動相的GPC凈化方法。固相小柱萃取(SPE)是一種常用的樣品前處理凈化技術，是液固萃取和液相色譜柱技術相結合的產(chǎn)物，能很好地實現(xiàn)目標物與樣品基體和干擾物的分離。本實驗對比了常用SPE小柱C18和HLB柱的凈化效果(圖1)，發(fā)現(xiàn)HLB柱的凈化效果及回收率優(yōu)于C18柱。其中擬柱胞藻毒素(CYN)由于極易溶于水，分子量小于其它幾種藻毒素，而很難在固相萃取柱上得到有效保留，所以回收率不高，但可以通過直接進樣或重復萃取富集步驟的方法提高其回收率(重復萃取富集步驟3次即可獲得較好的回收率)。綜上所述，本實驗最終選取HLB柱進行樣品凈化富集。

圖1 不同凈化方法效果的比較Fig.1 Effect comparison of different purification methods

圖2 兩種不同液相色譜小柱的色譜圖分離比較Fig.2 Chromatograms separation on two different liquid chromatographic columns

圖3 11種藻毒素MRM的TIC色譜圖Fig.3 MRM TIC chromatogram of 11 kinds of algal toxins1.CYN，2.MC-RR，3.NOD,4.MC-YR,5.MC-HtyR,6.MC-LR,7.MC-WR,8.MC-LA,9.MC-LY,10.MC-LW,11.MC-LF

2.1.2洗脫液及其用量的優(yōu)化對于極性樣品，常采用甲醇、乙腈等親水性有機溶劑作為洗脫液。因此本文優(yōu)化了不同洗脫液及其用量。結果發(fā)現(xiàn)，15 mL甲醇-0.2%甲酸水溶液(9∶1)的洗脫效果最佳。在甲醇中添加不同含量的甲酸(0.05%、0.1%、0.2%、0.3%、0.4%)進行洗脫，發(fā)現(xiàn)甲酸含量在0.05%～0.2%范圍時的回收率逐漸增加。這可能是因為加入甲酸后，藻毒素在酸性環(huán)境下多肽質(zhì)子化，同時也減少了其與硅膠表面硅醇基之間的相互作用，使其更易被洗脫，所以最終選擇甲醇-0.2%甲酸水溶液為洗脫液。

2.2 色譜及質(zhì)譜條件的優(yōu)化

2.2.1色譜條件的優(yōu)化分別比較了不同類型的反相色譜柱(Waters BEH C18、Waters HSS T3、Waters HSS C8)對待測物質(zhì)的色譜分離效果。結果表明(圖2)，擬柱胞藻毒素在Waters BEH C18色譜柱上幾乎不保留，在Waters HSS T3色譜柱上有保留，但其它藻毒素不能達到較好的分離。而其它10種藻毒素在Waters BEH C18色譜柱(50 mm×2.1 mm，i.d.1.7 μm)上獲得了理想的分離效果。綜合考慮，選用Waters BEH C18色譜柱作為分析柱。

甲醇和乙腈是液相色譜常用的流動相。在優(yōu)化的色譜分離條件下，考察了甲醇-水和乙腈-水流動相體系對目標物離子化程度的影響。實驗發(fā)現(xiàn)乙腈-水的儀器響應值高于甲醇-水。由于目標物的基本結構是7個氨基酸組成的單環(huán)多肽，在正離子電離模式下溶液中能夠電離出H+。所以，在流動相中適當加入酸性物質(zhì)可以促進目標物的電離，從而獲得較高的離子化效率。因此本文選取0.2%甲酸-水作為流動相梯度洗脫，并在5 min內(nèi)實現(xiàn)了目標化合物的快速分離，獲得了最佳實驗結果。

2.2.2質(zhì)譜條件的優(yōu)化根據(jù)微囊藻毒素具有多肽質(zhì)子化的化學電離性質(zhì)，本文選用正電離模式(ESI+)，采用蠕動泵直接進樣的方式進行質(zhì)譜條件優(yōu)化。根據(jù)CAC和EU第657/2002/EEC號決議有關規(guī)定，選擇兩對離子監(jiān)測MRM即可滿足要求。通過儀器自帶軟件Masslynx 4.1的自動優(yōu)化軟件IntelliStart，對目標物的錐孔電壓、碰撞能、定量離子和輔助定性離子進行了優(yōu)化。11種藻毒素的TIC色譜圖見圖3。

2.3 標準曲線、線性范圍及檢出限

將標準儲備液用流動相梯度稀釋成6種不同質(zhì)量濃度的標準溶液(0.5、1、5、10、20、50 μg/L)，采用本方法測定，以標準物的質(zhì)量濃度(x，μg/L)為橫坐標，對應峰面積(y)為縱坐標進行相關性回歸分析，得回歸方程及相關系數(shù)。并根據(jù)HJ168-2010中方法檢出限的一般確定方法，依據(jù)公式MDL=t(n-1，0.99)×S，通過重復空白試驗7次計算得各組分的檢出限為1.0～5.0 ng/kg，結果見表2。

表2 11種藻毒素的標準方程、相關系數(shù)、儀器檢出限及方法檢出限Table 2 Regression equation，correlation coefficient，instrument detection limit and method detection limit of 11 kinds of algal toxins

2.4 方法的回收率與精密度

對一未檢出目標物的實際環(huán)境樣品進行加標回收率和精密度實驗，樣品分別添加0.1、1.0、4.0 μg/kg 3個水平的標準溶液，每個加標水平平行6次，按本方法進行測定。計算得方法回收率及相對標準偏差(RSD)結果見表3。

表3 11種藻毒素的加標回收率和相對標準偏差(n=6)Table 3 Recoveries and relative standard deviations of 11 kinds of algal toxins(n=6)

2.5 樣品的測定

圖4 實際樣品的TIC色譜圖Fig.4 TIC chromatogram of real sample

于12個不同時期在環(huán)巢湖湖面及入湖河流的23個監(jiān)測點位采集了沉積物，應用本方法進行分析測定，實際樣品譜圖見圖4。分析結果表明，有14組樣品檢出4種藻毒素(MC-LR，MC-RR，MC-LW和MC-LF)，含量為19.3～127.4 ng/kg。

3 結 論

建立了超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用技術同時快速測定沉積物中11種藻毒素的方法。沉積物經(jīng)冷凍干燥、粉碎過篩，超聲提取，經(jīng)HLB固相萃取小柱凈化，超高效液相色譜分離，串聯(lián)質(zhì)譜電噴霧正離子模式下采用多級離子監(jiān)測方式檢測，外標法定量。該方法檢出限為1.0～5.0 ng/kg，優(yōu)于已有文獻[6]。對巢湖湖區(qū)及入湖河流的沉積物進行了研究調(diào)查，結果顯示，在不同時期均不同程度地檢出了相關藻毒素。該方法快速、靈敏、準確，可有效應用于沉積物中藻毒素的實際監(jiān)測。

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Rapid Determination of 11 Algal Toxins in Sediments by Ultra Performance Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry

ZHAO Bin1，WANG Zhao2，ZHANG Min1*，ZHANG Fu-hai1，TIAN Bing-zheng1，DING Lei2

(1.Anhui Environmental Monitoring Center，Hefei 230071，China；2.Inspection and Quarantine Technology Center，Anhui Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau,Hefei 230031，China)

A method was established for the rapid determination of 11 algal toxins in sediments by ultra performance liquid chromatography - tandem mass spectrometry.Firstly，the sample was freezingly dried out，and then sieved，followed by purification with 0.1 mol/L EDTA-Na4P2O7solution and HLB solid phase extraction column，elution with methanol-0.2% formic acid，and finally concentrated and mixed with nitrogen to 1 mL.The separation of the analyte was performed on a Waters BEH C18chromatographic column with acetonitrile -0.2% formic acid solution as mobile phase by gradient elution.The sample was analyzed by ultra performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry in positive ions electrospray mode under multi-stage monitoring mode (MRM)，and quantified by external standard method.The results showed that the detection limits for 11 algal toxins in sediment were in the range of 1.0-5.0 ng/kg.The average recoveries for the same environmental samples at three spiked concentrations of 0.1，1.0，4.0 μg/kg were in the range of 70.3%-112.5% with relative standard deviations of 2.2%-9.3%.The method was rapid，sensitive and accurate，and could be effectively applied in the rapid monitoring of 11 algal toxins in sediments.

sediments；algal toxin；ultra performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry(UPLC-MS/MS)

O657.7；O657.63

:A

：1004-4957(2017)09-1133-06

2017-04-25；

：2017-05-24

環(huán)保部科技基金資助項目(AH20161001)；安徽省環(huán)境保護科研項目(20131008)

*

：張 敏，碩士，教授級高工，研究方向：環(huán)境保護監(jiān)測理論與新技術，Tel:18919635957，E-mail: 298889005@qq.com

10.3969/j.issn.1004-4957.2017.09.014