三種抗菌藥物對(duì)羊源大腸桿菌抗菌活性的研究

邵莉萍+李宏勝+妥鑫

摘要：采用微量肉湯稀釋法測(cè)定最小抑菌濃度（MIC），研究抗菌藥物恩諾沙星、環(huán)丙沙星、加替沙星對(duì)21株羊源大腸桿菌臨床分離株的體外抗菌活性，從而觀察大腸桿菌對(duì)幾類抗菌藥物的敏感性。結(jié)果表明，大腸桿菌對(duì)恩諾沙星、環(huán)丙沙星、加替沙星的敏感率分別為0.00、66.7%、61.9%，耐藥率分別為47.6%、14.3%、33.3%。恩諾沙星、環(huán)丙沙星、加替沙星均對(duì)大腸桿菌產(chǎn)生不同程度的耐藥性，其中恩諾沙星耐藥性最強(qiáng)，而環(huán)丙沙星耐藥性最弱。

關(guān)鍵詞：恩諾沙星；加替沙星；環(huán)丙沙星；大腸桿菌；耐藥性：敏感性

中圖分類號(hào)：S859.79+6 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：0439-8114（2018）01-0086-03

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2018.01.022

Abstract： The broth microdilution method is used to determine MIC，which aims to evaluate the activity of the Enrofloxacin，Ciprofloxacin and Gatifloxacin against the clinical Escherichia coli from sheeps（21 isolates），and the susceptible and resistance of the enrofloxacin，gatifloxacin and ciprofloxacin against E.coli was estimated. Result showed that，drugs susceptiblerates to Enrofloxacin，Ciprofloxacin and Gatifloxacin in E.coli are 0.00，66.7%，61.9%， and the drugs resistance rates to Enrofloxacin，Ciprofloxacin and Gatifloxacin in E.coli are 47.6%，14.3%，33.3%. Enrofloxacin，Ciprofloxacin，Gatifloxacin emerge the different resistantance to E.coil. The E.coil strains showed high drug resistance to Enrofloxacin，and showed low drug resistance to Ciprofloxacin.

Key words： Enrofloxacin； Gatifloxacin； Ciprofloxacin； Escherichia coli； drug resistance； sensibility

大腸埃希氏菌（Escherichia coli）俗稱大腸桿菌，屬埃希氏菌屬（Escherichia），為人和動(dòng)物腸道中的正常菌群之一。但是，在一定條件下，某些血清型的大腸桿菌會(huì)隨著動(dòng)物機(jī)體抵抗力低下而引起動(dòng)物患病，特別是對(duì)于嬰兒或者幼畜，常常引起嚴(yán)重腹瀉和敗血癥[1]。E.coli作為食源性疾病的主要致病菌之一，不僅在發(fā)展中國家常發(fā)，發(fā)達(dá)國家也不例外，許多國家曾經(jīng)都對(duì)其進(jìn)行過相關(guān)的報(bào)道[2]。它常常伴隨著動(dòng)物的屠宰加工或者奶制品的原料采集和生產(chǎn)等過程進(jìn)行感染，大量的數(shù)據(jù)證實(shí)食品動(dòng)物和奶制品是致病性大腸桿菌（Diarrheagenic E. Coli，DEC）傳播并導(dǎo)致人類或者動(dòng)物發(fā)病的主要媒介，例如牛肉、豬肉、羊肉以及家禽肉，其肉制品或者奶制品攜帶DEC的概率大概為2.84%和0.75%[3]。

羊腹瀉是羊養(yǎng)殖行業(yè)常見的腸道疾病之一，其主要致病菌之一為E.coil。羔羊作為易感群體，常常大規(guī)模發(fā)病，腹瀉嚴(yán)重時(shí)，死亡率高達(dá)50%，給畜牧養(yǎng)殖行業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失[4，5]。但是，由于抗菌藥物大量的濫用，使得羊源大腸桿菌產(chǎn)生耐藥性，并且其耐藥性逐年在增強(qiáng)。近幾年，大腸桿菌的多重耐藥菌株和交叉耐藥菌株在臨床上多次被分離和報(bào)道，尤其對(duì)青霉素和紅霉素的耐藥性可達(dá)到90%以上[6]。喹諾酮類化合物是一類人工合成的含4-喹諾酮基本結(jié)構(gòu)的抗菌劑，對(duì)革蘭氏陰性菌具有良好的抗菌活性和較強(qiáng)的藥代學(xué)特性，自20世紀(jì)60年代問世以來，已經(jīng)經(jīng)歷4代的結(jié)構(gòu)改造與修飾，目前獸醫(yī)臨床常用的為第三代的環(huán)丙沙星（Ciprofloxacin）和恩諾沙星（Enrofloxacin）以及第四代的加替沙星（Gatifloxacin），其中恩諾沙星在獸醫(yī)臨床中應(yīng)用最為廣泛[7，8]。但是，自2000年以來，獸醫(yī)臨床上常見致病菌對(duì)喹諾酮類藥物產(chǎn)生耐藥性的現(xiàn)象在疾病的治療中越發(fā)普遍，特別是腸道大腸桿菌的耐藥性問題。為此，本文通過研究21株羊源大腸桿菌臨床分離菌對(duì)喹諾酮類藥物恩諾沙星、加替沙星、環(huán)丙沙星的耐藥性，為獸醫(yī)臨床合理用藥提供數(shù)據(jù)支持，從而避免臨床大腸桿菌耐藥問題的進(jìn)一步惡化。

1 材料與方法

1.1 藥品及試劑

恩諾沙星，純度98%，由北京索萊寶科技有限公司提供；環(huán)丙沙星、加替沙星，純度均為98%，均由上海麥克林生化科技有限公司提供。

CAMHB培養(yǎng)基購自青島海博生物技術(shù)有限公司，新生牛血清購自浙江天杭生物科技有限公司。

1.2 菌株

羊源大腸桿菌臨床分離株21株，分離于甘肅省臨夏某牛場(chǎng)；質(zhì)控菌株金黃色葡萄球菌ATCC 29213、糞腸球菌ATCC 29212，均購自美國組織培養(yǎng)庫（ATCC）。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 培養(yǎng)基的配制 將液體培養(yǎng)基CAMHB按照產(chǎn)品要求配制一定體積的培養(yǎng)液，高壓滅菌之后，置于4 ℃冰箱備用。endprint

1.3.2 抗菌藥液的制備 試驗(yàn)前精密稱取恩諾沙星、環(huán)丙沙星、加替沙星，無菌操作配制成2 048 μg/mL的藥液，置于4 ℃冰箱保存?zhèn)溆?，臨用前用相應(yīng)的細(xì)菌培養(yǎng)液稀釋至試驗(yàn)需要濃度。恩諾沙星、加替沙星用去離子水作溶劑，振蕩30 min；環(huán)丙沙星用甲醇作溶劑，振蕩30 min。

1.3.3 標(biāo)準(zhǔn)菌液制備 打開超凈工作臺(tái)，用無菌接種環(huán)挑取1個(gè)單菌落，接種至CAMHB液體培養(yǎng)基中，于37 ℃振蕩培養(yǎng)5 h后，用無菌CAMHB培養(yǎng)基稀釋菌液，直至菌液濃度為1×108 CFU/mL。

1.4 最小抑菌濃度（MIC）的測(cè)定

采用微量肉湯稀釋法分別測(cè)定待測(cè)藥物對(duì)每株菌株的MIC，試驗(yàn)參考標(biāo)準(zhǔn)為美國臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)協(xié)會(huì)（CLSI）[9，10]。將一定濃度的待測(cè)藥物倍比稀釋到96孔板各試驗(yàn)孔中，稀釋梯度為13個(gè)梯度，濃度范圍為0.0625～256 μg/mL。然后用無菌CAMHB培養(yǎng)液稀釋已調(diào)節(jié)至1×108 CFU/mL濃度的菌液，稀釋后的菌液在15 min內(nèi)完成接種，保證每孔細(xì)菌的終濃度為5×105 CFU/mL，以及保證每孔對(duì)應(yīng)的藥物濃度分別為相應(yīng)的13個(gè)梯度所對(duì)應(yīng)的濃度。陰性對(duì)照組為接種了細(xì)菌的細(xì)菌培養(yǎng)液。當(dāng)陰性對(duì)照組長(zhǎng)出細(xì)菌時(shí)，試驗(yàn)結(jié)果方可采納。

2 結(jié)果與分析

藥物對(duì)21株羊源大腸桿菌的MIC結(jié)果見表1和表2。試驗(yàn)結(jié)果表明，恩諾沙星和環(huán)丙沙星的MIC50值相同，均為2 μg/mL，加替沙星的MIC50值略低于恩諾沙星和環(huán)丙沙星，為1 μg/mL，對(duì)于MIC90，除了環(huán)丙沙星為2 μg/mL之外，加替沙星和恩諾沙星相同，其值為≥32 μg/mL。

藥物對(duì)21株羊源大腸桿菌的耐藥率（Resistance）與敏感率（Susceptible）結(jié)果見表3。試驗(yàn)結(jié)果表明，羊源大腸桿菌對(duì)環(huán)丙沙星最敏感（66.7%），耐藥率（14.3%）最低。對(duì)于加替沙星和恩諾沙星，羊源大腸桿菌對(duì)恩諾沙星不敏感（0.00），耐藥性也是喹諾酮類藥物當(dāng)中最高的，為47.6%；對(duì)加替沙星的耐藥率為33.3%，敏感率為61.9%。

3 小結(jié)與討論

試驗(yàn)結(jié)果表明，喹諾酮類藥物恩諾沙星對(duì)羊源大腸桿菌的耐藥性最顯著，為47.6%，并且對(duì)E. Coli不敏感；而環(huán)丙沙星對(duì)羊源大腸桿菌最敏感，其敏感率為66.7%，而耐藥性僅為14.3%。由此可以發(fā)現(xiàn)，甘肅省臨夏一帶的羊源E. Coli對(duì)環(huán)丙沙星仍然具有一定的敏感性，對(duì)恩諾沙星卻已經(jīng)產(chǎn)生一定程度的耐藥性。但是其他省份和地區(qū)有關(guān)大腸桿菌對(duì)喹諾酮類藥物的耐藥性和敏感性報(bào)道卻與本試驗(yàn)結(jié)果并不一致，說明大腸桿菌的耐藥性呈現(xiàn)一定的區(qū)域特性。

由于大腸桿菌在中國各個(gè)地區(qū)均呈現(xiàn)出嚴(yán)重的耐藥現(xiàn)狀，且表現(xiàn)出地區(qū)差異性，耐藥基因可以通過質(zhì)粒水平進(jìn)行傳染，從而給養(yǎng)殖行業(yè)帶來嚴(yán)重威脅。因此，為防止大腸桿菌耐藥情形進(jìn)一步擴(kuò)大蔓延和加重，應(yīng)該采取有效措施進(jìn)行應(yīng)對(duì)，比如聯(lián)合科研機(jī)構(gòu)根據(jù)大腸桿菌不同耐藥機(jī)理進(jìn)行新藥創(chuàng)制，或者積極向相關(guān)部門反映情況，引起其重視，從而采取相應(yīng)措施來加強(qiáng)耐藥菌的檢測(cè)，以減少更多耐藥情況的惡化。

參考文獻(xiàn)：

[1] 張海月，康元環(huán)，王姣姣，等.大腸桿菌生物被膜與耐藥性的關(guān)系[J].中國獸藥雜志，2015，49（6）：62-65.

[2] CROWE S J，MAHON B E，VIEIRA A R，et al. Vital signs： Multistate foodborne outbreaks-United States，2010-2014[J].Mmwr Morbidity & Mortality Weekly Report，2015，64（43）：1221.

[3] GONZ？魣LEZ J，SANSO A M，LUCCHESI P M，et al. Comparison of 2 proposed MLVA protocols for subtyping non-O157：H7 verotoxigenic Escherichia coli[J].Diagnostic Microbiology & Infectious Disease，2014，78（4）：328-332.

[4] MALUTA R P，F(xiàn)AIRBROTHER J M，STELLA A E，et al. Potentially pathogenic Escherichia coli，in healthy，pasture-raised sheep on farms and at the abattoir in Brazil[J].Veterinary Microbiology，2014，169（1-2）：89.

[5] 張希利，趙萬軍，晁旭東，等.致羔羊腹瀉大腸桿菌的分離鑒定[J].新疆農(nóng)墾科技，2016，39（2）：35-36.

[6] WANG L，NAKAMURA H，KAGENAKADAI E，et al. Prevalence，antimicrobial resistance and multiple-locus variable-number tandem-repeat analysis profiles of diarrheagenic Escherichia coli isolated from different retail foods[J].International Journal of Food Microbiology，2017，249：44-52.

[7] CHENG G，HAO H，DAI M，et al. Antibacterial action of quinolones：from target to network[J].ChemInform，2013，66（42）：555-562.

[8] HOOPER D C，JACOBY G A. Mechanisms of drug resistance： quinolone resistance[J].Annals of the New York Academy of Sciences，2015，1354（1）：12.

[9] WIEGAND I，HILPERT K，HANCOCK R E. Agar and broth dilution methods to determine the minimal inhibitory concentration （MIC） of antimicrobial substances[J].Nature protocols，2008，3（2）：163-75.

[10] SADER H S，BIEDENBACH D J，PAUKNER S，et al. Antimicrobial activity of the investigational pleuromutilin compound BC-3781 tested against Gram-positive organisms commonly associated with acute bacterial skin and skin structure infections[J].Antimicrobial Agents & Chemotherapy，2012，56（3）：1619-1623.endprint