陸地棉‘洞A’育性研究時期的選擇與花蕾外部形態(tài)指標間的關(guān)系

劉冬梅　周步進　靳明凱　周瑞陽

摘 要：為了分子生物學研究取材方便，確定了陸地棉‘洞A花粉發(fā)育時期與花蕾外部形態(tài)對應關(guān)系：花蕾直徑d=1～2 mm為減數(shù)分裂期；d=2～3 mm是4分體形成初期；d=3～4 mm為4分體期；d=4～5 mm處于雙核期；d=5 mm為花粉粒形成初期；d=6 mm是成熟花粉期。

關(guān)鍵詞：陸地棉洞A；花粉；發(fā)育期；花蕾

中圖分類號：S562 文獻標識碼：A DOI編碼：10.3969/j.issn.1006-6500.2013.06.001

陸地棉‘洞A是一系兩用、增產(chǎn)10%～20%、且纖維品質(zhì)優(yōu)于常規(guī)棉花的品種，利用‘洞A系已培育出4個陸地棉種內(nèi)品種：川雜1號，川雜2號，川雜3號和川雜4號，并在此基礎(chǔ)上衍生了一系列抗病、蟲不育系?！碅不育株與可育株除了在育性上存在差異外，在遺傳背景上高度同源，是研究棉花花藥與花粉發(fā)育相關(guān)基因的理想材料。如何選擇最佳時間點，成為一個獲得關(guān)鍵基因成功的關(guān)鍵。陸地棉‘洞A是1972年在‘洞庭一號中發(fā)現(xiàn)的一個天然不育突變株，經(jīng)過連續(xù)回交選育而獲得的[1]。遺傳分析表明受一對隱性核基因控制，命名為msc1[2]。1992年，鑒定為新基因，定名為ms14[3]。20世紀80年代至今，對于‘洞A的研究主要集中在細胞學觀察及生化研究，對于分子生物學研究基礎(chǔ)薄弱。目前僅限于胡磊[4]使用BSA法獲得2個與ms14基因連鎖的標記，分別是BNL3971和NAU663，其中標記BNL3971距離ms14基因最近，相距16.7 cM。根據(jù)已公布的棉花圖譜將ms14基因定位在了Chr.2上。另外，應用cDNA-AFLP技術(shù)，分析‘洞A雄性不育、可育材料花粉發(fā)育相關(guān)基因表達的差異，得到64條差異片段[5]。在植物發(fā)育的主要階段至少有60 000個不同的結(jié)構(gòu)基因表達，其中大多數(shù)為所有看家基因。Kamalay等[6]和Goldberg等[7]比較了花和營養(yǎng)器官的mRNA后發(fā)現(xiàn)，大約有10 000種mRNA為花藥特異性的。盡管在花粉發(fā)育過程中，涉及近萬種特異基因的表達，但是自從1987年第一次分離出植物的花藥、花粉特異性基因以來，迄今所發(fā)現(xiàn)的花粉發(fā)育特異基因也不過幾十種。這些花粉特異基因在植物發(fā)育過程中的表達，是受時間和空間調(diào)節(jié)的。除去某些持續(xù)表達的基因外，Mascarenhas[8]將花粉形成過程中的基因表達分成早晚兩個時期，早期基因的表達主要集中在減數(shù)分裂后即小孢子單核早期，而在成熟花粉中減少或完全消失；晚期基因的轉(zhuǎn)錄最早發(fā)生于小孢子有絲分裂時期，并且隨著花粉的成熟繼續(xù)積累。一般認為早期基因可能編碼細胞骨架蛋白和參與細胞壁形成、淀粉積累的蛋白質(zhì)。晚期基因表達的蛋白質(zhì)則在花粉成熟和花粉萌發(fā)時起作用。‘洞A不育株從小孢子母細胞到小孢子成熟的各個時期都產(chǎn)生不同程度的敗育，最主要敗育時期為小孢子單核時期[9]。侯磊等[5]研究發(fā)現(xiàn)：在花藥發(fā)育的相同時期，不育和可育花粉的譜帶在單核期的差異大于減數(shù)分裂期。花粉的內(nèi)部發(fā)育與外部形態(tài)間有一定的穩(wěn)定關(guān)系，而確定花粉的發(fā)育時期對于取材用于不育相關(guān)基因的研究將十分重要。到目前為止，未見系統(tǒng)出現(xiàn)從陸地棉‘洞A的花蕾外部形態(tài)指標來判斷不育株花粉的發(fā)育時期的文獻。筆者旨在確定‘洞A最重要敗育時期即小孢子單核早期（四分體期）與外部形態(tài)的對應關(guān)系，并提供圖片依據(jù)，進而可以準確、便捷地進行取材。同時對‘洞A花粉發(fā)育影響因素進行討論，為不育基因的研究提供方法和理論的參考。

1 材料和方法

1.1 材 料

2011年在南寧市區(qū)試驗田對陸地棉‘洞A花粉的發(fā)育時期進行4次調(diào)查，4分體時期的花蕾直徑：8月31日，d=3～4 mm； 9月13日，d=3～4 mm；9月28日，d=4～5 mm；10月26日，d=4～5 mm。

1.2 方 法

1.2.1 取材 在花期分別標記不育株和可育株，分別摘取不同大小的不育株和可育株花蕾，速放置冰上，做到隨摘隨放。為了確定花蕾的外部形態(tài)和內(nèi)部發(fā)育之間的關(guān)系，用千分尺量取花蕾最大直徑處，為了達到準確一致，采取千分尺與鈴柄平行的方式，直徑每隔1 mm取1次樣，直至成熟花粉。

1.2.2 光學顯微觀察 用鑷子在花蕾上形成丁字切口，剝開苞片，選取少量花蕾中間部分花藥，置于載玻片上，先用鑷子盡量夾碎，滴1滴蒸餾水，蓋上蓋玻片，用帶橡皮的鉛筆豎直敲打蓋玻片，使花藥壁破碎更加徹底，Leica DM-LB型光學顯微鏡下觀察拍照。

2 結(jié)果與分析

陸地棉‘洞A不育是受一對隱性基因（ms·ms）控制的，當一對基因均為ms（純合）時，植株表現(xiàn)為雄性不育；一對基因中其中一個為顯性基因Ms（雜合）時，植株表現(xiàn)為可育。親本繁育時，用可育株（Ms·ms）的花粉授于不育株（ms·ms）的花， 所產(chǎn)的種子來年種植后，可育株與不育株仍各為50% ，因一系兩用（不育系、保持系），故稱兩用系。從圖1可以看出，不育株花藥不開裂，花藥細小，柱頭較長；可育株花粉散開，較粗壯。

3 結(jié)論與討論

從以上細胞學研究的結(jié)果，歸納出‘洞A花粉發(fā)育時期與外部形態(tài)對應關(guān)系：花蕾直徑d=1～2 mm為減數(shù)分裂期；d=2～3 mm是4分體形成初期；d=3～4 mm處于4分體期；d=4～5 mm是雙核期；d=5 mm為花粉粒形成初期；d=6 mm是成熟花粉期。小孢子從4分體初期（小孢子單核早期）開始，出現(xiàn)明顯的敗育現(xiàn)象，如4分體間的橫隔消失、內(nèi)容物減少、外泄，有的內(nèi)容物全部消失等現(xiàn)象，致使發(fā)育停滯。即使可以進入下一階段，也不能發(fā)育成具有育性的花粉粒。說明小孢子單核早期是敗育的最主要和關(guān)鍵時期，此時期也是研究育性轉(zhuǎn)換關(guān)鍵基因的最佳時期。

郝天峰等[12]研究了‘洞A不育系的衍生系抗A1不育株為低溫不育、高溫可育，與光照關(guān)系不大?；ǚ哿康亩嗌倥c其開花前7～11 d和9～13 d的日平均溫度呈極顯著正相關(guān)關(guān)系，因此，初步認為其育性轉(zhuǎn)換的敏感期為開花前7～13 d。棉花核不育系抗A1育性轉(zhuǎn)換不育株后代，在處理溫度為25～26 ℃條件下，表現(xiàn)完全不育；27～28 ℃出現(xiàn)不育和半不育并存的現(xiàn)象；在29 ℃表現(xiàn)完全可育。從其結(jié)果可以看出，抗A1育性轉(zhuǎn)換的開關(guān)的不育株上，高溫就可以轉(zhuǎn)變成可育株。但從‘洞A在田間的表現(xiàn)來看，高溫時可育株的數(shù)量并沒有增加，只是低溫會使可育株育性降低。調(diào)取南寧市區(qū)4次調(diào)查前10 d的日平均氣溫，分別是：24.7，24.5，20.3，19.8 ℃。從結(jié)果可以看出，溫度在24.5 ℃以上的時候，對花粉發(fā)育沒有影響，可以按照筆者研究的結(jié)果進行取材。關(guān)于植物雄性不育花粉敗育過程前人早有評述，認為花粉敗育的形式和時期是多種多樣的，隨植物不同而異，敗育時期受遺傳和環(huán)境相互作用所制約。對于陸地棉不育系‘洞A育性轉(zhuǎn)化的條件還有待于進一步研究。

參考文獻：

[1] 唐雯，張相.棉花“洞A”型核雄性不育形態(tài)及機理研究現(xiàn)狀[J].安徽農(nóng)業(yè)科學，2008，36（4）：1402-1404.

[2] 黃觀武，張東銘，茍云高，等.對我國陸地棉雄性不育基因的初步分析[J].四川農(nóng)業(yè)科技，1982（2）：1-4.

[3] 張?zhí)煺妫T義軍，潘家駒.我國發(fā)現(xiàn)的4個棉花核雄性不育系的遺傳分析[J].棉花學報，1992（4）：1-8.

[4] 胡磊.棉花核雄性不育基因ms_（14）及農(nóng)藝性狀SSR分子標記定位的研究[D].烏魯木齊：新疆農(nóng)業(yè)大學，2009.

[5] 侯磊，肖月華，李先碧，等.棉花洞A雄性不育系花藥發(fā)育的mRNA差別顯示[J].遺傳學報，2002，29 （4）：359-363.

[6] Kamalay J C， Goldberg R B.Organ-specific nuclear RNAs in tobacco[J]. Proc Natl Acad Sci， 1984，81（9）：2801-2805.

[7] Goldberg R B，Beals T P，Sanders P M.Anther development：Basic principles and practical applications[J].Plant Cell，1993，5（10）：1217-1229.

[8] Mascarenhas J P.Gene activity during pollen development[J]. Annual Review of Plant Physiology and Plant Molecular Biology，1990（41）：317-338.

[9] 湯澤生，杜素瓊，王祖秀，等.棉花“洞A”小孢子發(fā)育的細胞形態(tài)學研究補遺[J].南充師院學報：自然科學版，1982（2）：28-31.

[10] 湯澤生.棉花雄性不育論文集[M].成都：四川省科學技術(shù)出版社，1989.

[11] 湯澤生，王祖秀，徐林，等.棉花海洞不育系小孢子敗育的研究 [J].南充師院學報：自然科學版，1985（2）：1-3.

[12] 郝天峰，何覺民，郭宗學，等.花核不育系抗A1育性轉(zhuǎn)換不育株育性變化與溫度的關(guān)系[J].廣東農(nóng)業(yè)科學，2007（3）：13-15.