葫蘆科作物功能基因組學(xué)研究進(jìn)展

趙勝杰　路緒強(qiáng)　朱紅菊等

摘 要： 近些年，植物基因組學(xué)研究發(fā)展迅速，已進(jìn)入功能基因組研究的新階段，一些新的技術(shù)和方法不斷涌現(xiàn)。西瓜、甜瓜和黃瓜是葫蘆科重要的經(jīng)濟(jì)作物，其功能基因組學(xué)研究雖然起步較晚，但也取得了初步成果。綜述了近幾年植物功能基因組學(xué)主要研究方法如表達(dá)序列標(biāo)簽（EST）、TILLING技術(shù)、DNA芯片和RNA干涉（RNAi）等在西瓜、甜瓜和黃瓜上的應(yīng)用概況，并展望了未來葫蘆科作物功能基因組研究的發(fā)展趨勢(shì)。

關(guān)鍵詞： 功能基因組； 西瓜； 甜瓜； 黃瓜

功能基因組學(xué)（functional genomics），又被稱為后基因組學(xué)（post-genomics），它是利用結(jié)構(gòu)基因組學(xué)提供的豐富信息和產(chǎn)物，借助高通量、大規(guī)模的試驗(yàn)分析方法，在全基因組或系統(tǒng)水平上研究基因的功能，弄清生物體中各組分是如何工作并形成有功能的細(xì)胞、組織及整個(gè)生物體[1]。其目標(biāo)是明確基因組中全部基因的功能， 揭示植物生長(zhǎng)發(fā)育、環(huán)境應(yīng)答互作的分子網(wǎng)絡(luò)， 從而全面闡釋植物的生物學(xué)基礎(chǔ)。目前，水稻、擬南芥等模式植物功能基因組學(xué)研究發(fā)展較快，近幾年隨著科技進(jìn)步和資金投入的不斷增加，葫蘆科作物基因組研究也取得了一定的成果。西瓜基因組全長(zhǎng)約425 Mb，甜瓜約450 Mb，黃瓜約376 Mb[2]， 基因組大小比較適合開展基因組測(cè)序和功能基因組研究。2007年由西班牙牽頭組織，美國(guó)、中國(guó)、法國(guó)、以色列、日本等國(guó)家的14個(gè)實(shí)驗(yàn)室聯(lián)合啟動(dòng)了國(guó)際葫蘆科基因組計(jì)劃（International Cucurbit Genomics Initiative，ICuGI），該計(jì)劃為瓜類蔬菜的基因組學(xué)研究奠定了良好的技術(shù)平臺(tái)。在此基礎(chǔ)上，2008年相繼啟動(dòng)了葫蘆科三大作物西瓜、甜瓜、黃瓜的全基因組測(cè)序計(jì)劃[3]。隨著基因組測(cè)序工作的陸續(xù)完成，瓜類作物基因組研究逐步進(jìn)入到功能基因組研究時(shí)代。本文綜述了近些年植物功能基因組學(xué)主要研究方法在西瓜、甜瓜以及黃瓜上的應(yīng)用概況。

1 高通量、大規(guī)模EST測(cè)序及功能解析

EST（Express Sequence Tag）是指通過對(duì)cDNA 文庫(kù)中隨機(jī)挑取的克隆進(jìn)行大規(guī)模測(cè)序所獲得的cDNA 的5或3端序列，長(zhǎng)度一般為150～500 bp。EST是基因編碼序列的一部分，通過與數(shù)據(jù)庫(kù)中已知功能的基因序列進(jìn)行對(duì)比，從理論上可推測(cè)其基因功能。EST已發(fā)展成為新基因發(fā)現(xiàn)的有效途徑，也是植物功能基因組學(xué)研究的重要工具。隨著測(cè)序技術(shù)的不斷改良和測(cè)序成本的降低，高通量、大規(guī)模EST測(cè)序及功能解析開始廣泛應(yīng)用。

西瓜EST研究方面，A. Levi 等[4]通過與葉片cDNA消減雜交構(gòu)建了西瓜果實(shí)發(fā)育不同時(shí)期（授粉后12、24、36 d）果肉消減cDNA文庫(kù)，獲得了832條無冗余EST，序列比對(duì)分析表明有410個(gè)EST-unigenes與已知編碼蛋白的基因同源，按功能歸類分屬于初級(jí)代謝、氨基酸合成組裝、細(xì)胞膜運(yùn)輸、細(xì)胞分裂、細(xì)胞壁代謝、細(xì)胞骨架和細(xì)胞形成、基因轉(zhuǎn)錄和表達(dá)、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、抗性防御和次級(jí)代謝。這些潛在的功能基因序列為日后開展西瓜果實(shí)發(fā)育和品質(zhì)形成的遺傳與功能基因組研究奠定了基礎(chǔ)。呂桂云等[5]通過構(gòu)建枯萎病菌誘導(dǎo)的西瓜根系組織SSH-cDNA文庫(kù)，對(duì)測(cè)序獲得的4 431條高質(zhì)量EST序列進(jìn)行聚類拼接，獲得1 756個(gè)非重復(fù)序列，基因功能分類表明抗病與防御相關(guān)基因約占36.3%，對(duì)獲得的西瓜與枯萎病非親和互作中部分特異性表達(dá)的基因進(jìn)行了初步探討，發(fā)現(xiàn)可能參與西瓜與枯萎病菌非親和互作的轉(zhuǎn)錄因子、激酶和防衛(wèi)基因及茉莉酸和木質(zhì)素2個(gè)主要代謝途徑。Guo等[6]采用Roche/454新一代測(cè)序技術(shù)，從西瓜4個(gè)果實(shí)發(fā)育期（授粉后10、18、26、34 d）獲得了577 023個(gè)高質(zhì)量EST，組裝成了75 068個(gè)unigenes，有54.9% 的unigenes與GeneBank中的已知基因同源，其中2/3來源于黃瓜。Gene Ontology （GO）注釋表明，有33 853個(gè)unigenes（45.1%）獲得至少1個(gè)GO術(shù)語，被注釋序列的基因功能分屬于分子功能（molecular function）類別、生物過程（biological process）類別和細(xì)胞組分（cellular component）類別，所占比例分別為38.6%、38.6%和36%，另外大約29%的unigenes同時(shí)具有以上3種功能分類。生物過程類別的基因主要參與細(xì)胞過程、代謝過程和生物合成過程，表明果肉組織在發(fā)育過程中發(fā)生了廣泛的代謝活動(dòng)。數(shù)字基因表達(dá)譜分析及實(shí)時(shí)定量PCR驗(yàn)證表明有3 023個(gè)基因在果實(shí)發(fā)育不同時(shí)期存在顯著的表達(dá)差異，表達(dá)量差異至少在2倍以上。研究發(fā)現(xiàn)細(xì)胞壁相關(guān)基因在未成熟白瓤果肉組織中高效表達(dá)，而類葫蘆卜素代謝基因（八氫番茄紅素合成酶和番茄紅素-β環(huán)化酶）、蔗糖代謝基因（蔗糖磷酸合成酶、蔗糖合成酶）在果實(shí)發(fā)育不同時(shí)期差異表達(dá)明顯，作者對(duì)與果實(shí)品質(zhì)相關(guān)的一些生化途徑如纖維素合成、木栓質(zhì)合成、葡萄糖合成降解以及淀粉合成降解等進(jìn)行了進(jìn)一步鑒定。

甜瓜大規(guī)模EST測(cè)序及功能解析方面，Nurit Katzir等[7]通過構(gòu)建甜瓜EST數(shù)據(jù)庫(kù)，從4 800條序列中鑒定出與甜瓜果實(shí)香味代謝相關(guān)的3類基因家族，乙醇乙酰轉(zhuǎn)移酶、倍半萜合酶和類胡蘿卜素裂解雙加氧酶，克隆得到候選基因的全長(zhǎng)序列，研究了這些基因在不同甜瓜品種間的表達(dá)模式。Daniel Gonzalez-Ibeas等[8]通過對(duì)8個(gè)來源于甜瓜不同組織和生理狀態(tài)的cDNA文庫(kù)（包括授粉后15 d和46 d的2個(gè)果實(shí)的文庫(kù)）測(cè)序和序列拼接、組裝，獲得16 637個(gè)無冗余EST。通過與擬南芥基因組做生物信息學(xué)比對(duì)分析，發(fā)現(xiàn)眾多個(gè)與果實(shí)發(fā)育相關(guān)的基因，如ACC合成酶、ACC氧化酶、細(xì)胞壁代謝酶、類胡蘿卜素合成代謝酶、MADS-box 基因等。實(shí)時(shí)定量PCR表明在果實(shí)成熟期乙烯受體基因EIN4表達(dá)量翻倍，表明該基因與果實(shí)成熟期乙烯信號(hào)調(diào)控相關(guān)。MADS-box 基因SVP在果實(shí)成熟期表達(dá)量下降了4倍，番茄紅素ε環(huán)化酶基因（LUT2）和木葡聚糖內(nèi)糖基轉(zhuǎn)移酶基因（TCH4）表達(dá)量也下降了4倍。2011年，Christian Clepet等[9]構(gòu)建了4個(gè)不同類型甜瓜品種不同植物組織的11個(gè)全長(zhǎng)cDNA文庫(kù)和4個(gè)標(biāo)準(zhǔn)化cDNA文庫(kù)，分別獲得71 577 條和22 179條EST，能夠組裝成24 444條unigenes，基因?qū)Ρ蕊@示有75%～85%的序列與雙子葉植物同源，70%與單子葉植物同源，有6 972個(gè)基因家族在雙子葉植物和單子葉植物間具有保守性。對(duì)數(shù)字基因表達(dá)譜研究，結(jié)果表明有175個(gè)基因?yàn)榻M織特異表達(dá)，這些基因?yàn)槲磥黹_展功能基因組研究提供了寶貴的資源。作者從這些序列中鑒定出了4 068個(gè)SSR和3 073個(gè)SNP，并對(duì)1 382個(gè)全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行了分析。為了解甜瓜對(duì)鹽脅迫的抗性反應(yīng)機(jī)制，Shiwei Wei等[10]構(gòu)建了耐鹽甜瓜品種根系組織的抑制消減雜交（SSH）cDNA文庫(kù)，測(cè)序獲得262條uni-ESTs，有161條序列與已知基因高度同源，128條與未知功能基因同源，有很多基因顯示與生物和非生物脅迫相關(guān)。研究表明，甜瓜耐鹽受眾多蛋白質(zhì)調(diào)控，這些蛋白涉及細(xì)胞代謝、能量、轉(zhuǎn)錄、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、蛋白質(zhì)命運(yùn)以及細(xì)胞拯救和防御等生物過程，表明甜瓜作物耐鹽存在復(fù)雜的抗性反應(yīng)機(jī)制。

在黃瓜上面，Dae-Jae Kim[11]構(gòu)建了黃瓜子葉生長(zhǎng)不同時(shí)期的cDNA文庫(kù)，篩選出大量與衰老相關(guān)的基因，利用半定量RT-PCR分析了365個(gè)克隆，發(fā)現(xiàn)有很多基因表達(dá)量提高，這些基因有些功能已知，有些功能未知。齊曉花等[12]采用SMART 技術(shù)構(gòu)建了高抗白粉病的黃瓜品系JIN5-508 的葉片cDNA文庫(kù)，利用該文庫(kù)隨機(jī)挑選的8 352個(gè)克隆從5端進(jìn)行單向測(cè)序，共獲得8 035個(gè)有效的ESTs，序列的平均長(zhǎng)度為838 bp。從文庫(kù)中篩選出了大量的低豐度表達(dá)基因，約占unigene總數(shù)的72.5%，1 991個(gè)unigenes 獲得分子功能注釋，其中與蛋白結(jié)合活性和催化活性相關(guān)的基因分別達(dá)到了41.34%和38.72%；在獲得功能注釋的unigene 中，有部分抗病抗逆相關(guān)基因高豐度表達(dá)，其中3個(gè)unigenes與擬南芥白粉病抗性基因Mlo2、Mlo8 和Mlo14 高度同源。盛慧等[13]利用抑制性消減雜交技術(shù)（SSH）構(gòu)建黃瓜胚胎發(fā)育早期和晚期差異表達(dá)cDNA文庫(kù)，經(jīng)反向Northern blot雜交檢測(cè)，共得到97個(gè)陽(yáng)性克隆。利用分子生物學(xué)軟件對(duì)測(cè)序后的序列進(jìn)行質(zhì)量檢測(cè)和聚類、拼接，共得到93個(gè)Uni-ESTs，其中包括86個(gè)singletons 和7個(gè)contigs。將上述EST序列在GenBank上進(jìn)行BLAST比對(duì)，有83個(gè)EST片段找到了與之匹配的同源序列，有10 個(gè)EST片段未找到同源序列，推測(cè)可能是新基因。其中很多EST與擬南芥、水稻或玉米蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)中的熱激蛋白具有很高的同源性。將以上序列進(jìn)行功能分類，發(fā)現(xiàn)在胚胎發(fā)育早期細(xì)胞防御和代謝過程占主要位置，而在胚胎發(fā)育晚期細(xì)胞防御和抗?jié)B透脅迫功能是非常重要的。Guo等[14]以黃瓜全雌系和雌雄同株系測(cè)序獲得353 941條EST，其中188 255條來源于全雌花，165 686條來源于雌雄花，結(jié)合5 600條GeneBank收錄的EST和mRNA序列，組裝成了81 401條unigenes。通過基因功能注釋和分析，預(yù)測(cè)了343個(gè)生化代謝途徑。對(duì)數(shù)字基因表達(dá)分析，表明大約200個(gè)基因在不同花性型存在差異表達(dá)，為研究植物花分化的分子機(jī)理提供了新的認(rèn)識(shí)。潘宇等[15]構(gòu)建了黃瓜授粉前后多個(gè)發(fā)育階段的幼果組織cDNA文庫(kù)，測(cè)序獲得116條EST，92.2% 的長(zhǎng)度在400 bp以上，19% 為重疊序列。在GeneBank中進(jìn)行BLAST分析后確認(rèn)與已知功能基因相似的EST序列有71條，有相似序列而功能未知的基因和沒有相似序列的EST序列各占19.83% 和18.97%。

2 TILLING技術(shù)

TILLING（targeting induced local lesions in

genomes，定向誘導(dǎo)基因組局部突變技術(shù)），該技術(shù)借助高通量、標(biāo)準(zhǔn)化的檢測(cè)手段，快速有效地從經(jīng)化學(xué)誘變劑（EMS）誘變過的突變?nèi)后w中鑒定出點(diǎn)突變。與傳統(tǒng)的插入突變比，TILLING技術(shù)利用傳統(tǒng)的化學(xué)誘變獲得突變體，不需要耗時(shí)的轉(zhuǎn)基因和復(fù)雜的組織培養(yǎng)過程，具有高通量、低成本、高效率等諸多優(yōu)勢(shì)。目前，TILLING作為一種全新的反向遺傳學(xué)研究方法已經(jīng)用于多種植物。

TILLING技術(shù)在葫蘆科作物上的應(yīng)用主要集中在甜瓜方面，2007年，Yaakov Tadmor等[16]最先用EMS誘變構(gòu)建了甜瓜品種Noy Yizreel的突變基因庫(kù)，共產(chǎn)生3 000個(gè)M2家系，發(fā)現(xiàn)了大量新的表型突變，大部分為隱性單基因控制。Fatima Dahmani-Mardas等[17]建立了甜瓜品種Char Mono （Cucumis melo L. subsp. melo var. cantalupensis）的TILLING技術(shù)平臺(tái)，CharMono系雌雄同株、呼吸躍變型，在M2代發(fā)現(xiàn)了大量子葉、莖蔓、花和果實(shí)發(fā)生的表型突變，利用與果實(shí)品質(zhì)相關(guān)的11個(gè)基因篩選突變株系，發(fā)現(xiàn)大約每隔573 kb會(huì)發(fā)生一個(gè)突變，大部分都是G/C 突變成 A/T ，也有G/C 到 C/G，T/A到 A/T和C/G到A/T的變異，外顯子測(cè)序表明31.3%為基因沉默突變，65.1%為錯(cuò)義，2.4%為轉(zhuǎn)錄終止，1.2%為拼接剪接突變，氨基環(huán)丙烷羧酸氧化酶基因CmACO1篩選到7個(gè)獨(dú)立的點(diǎn)突變，其中G194D果皮顏色變異明顯，果實(shí)延遲成熟黃化，而果形、可溶性固形物含量和果肉顏色仍然與野生型一樣。G194D自交純合株系也呈現(xiàn)出果實(shí)發(fā)育期延長(zhǎng)、果肉變硬和果實(shí)延熟，并且在2個(gè)不同試驗(yàn)地點(diǎn)表現(xiàn)一致，這些表型變異證明了G194D系CmACO1基因突變而來，該研究利用TILLING技術(shù)成功創(chuàng)造了甜瓜品質(zhì)新資源，顯著提高了品種貨架期。Mireia González等[18]建立了甜瓜品種Piel de Sapo （Cucumis melo subsp. melo var. inodorus）的TILLING技術(shù)平臺(tái)，Piel de Sapo系雄全同株、非呼吸躍變型，EMS誘變得到2 368個(gè)M2家系，用病毒侵染抗性相關(guān)的2個(gè)基因Cm-eIF4E（核細(xì)胞翻譯起始因子）、eIF（iso）4E（核細(xì)胞翻譯起始因子異構(gòu)體）、4個(gè)與果實(shí)成熟相關(guān)的基因ACO1、Cm-NOR、Cm-DET1、Cm-DHS（脫氧羧腐胺賴氨酸合酶）以及PDS（八氫番茄紅素去飽和酶）篩選突變株系，發(fā)現(xiàn)有4個(gè)Cm-eIF4E等位基因突變，推測(cè)其中的2個(gè)改變了蛋白質(zhì)功能，PDS有2個(gè)等位突變，發(fā)生在外顯子的突變改變了蛋白質(zhì)功能，造成了苗期白化表型突變。4個(gè)與果實(shí)成熟相關(guān)的基因在群體中篩選突變，得到8個(gè)突變的家系。徐美紅等[19]用PCR產(chǎn)物直接測(cè)序和克隆測(cè)序2種方法用于檢測(cè)這8個(gè)突變家系的堿基變化。在直接測(cè)序中，4個(gè)突變家系的測(cè)序結(jié)果清晰，能夠確認(rèn)堿基的變化；其他4個(gè)家系的結(jié)果不清晰，不能確認(rèn)堿基的改變。在克隆測(cè)序中，8個(gè)家系的測(cè)序結(jié)果均清晰，能夠直接確定目的基因的點(diǎn)突變。在2種方法的比較中，克隆測(cè)序的準(zhǔn)確率、效率明顯優(yōu)于直接測(cè)序法。

黃瓜方面，以色列的R. Fraenkel等[20]通過EMS誘變獲得了大約1 000個(gè)M2家系，在苗期發(fā)現(xiàn)了諸如植株矮化、子葉自發(fā)病變、黃（花）葉、白化苗、葉片卷曲、窄型黑色子葉等諸多表型突變，利用PDS-3（八氫番茄紅素去飽和酶）篩選突變株系，發(fā)現(xiàn)了4個(gè)突變家系，測(cè)序表明堿基突變均發(fā)生于基因內(nèi)含子區(qū)域，因此并未造成相應(yīng)的黃化表型突變。該套突變體庫(kù)為黃瓜反向遺傳學(xué)及基因功能研究奠定了很好的基礎(chǔ)。

西瓜作物TILLING技術(shù)的應(yīng)用尚未見正式報(bào)道，美國(guó)農(nóng)業(yè)部蔬菜研究實(shí)驗(yàn)室的科學(xué)家目前正在從事相關(guān)的工作，預(yù)計(jì)將很快取得進(jìn)展。

3 DNA芯片

DNA芯片是利用已知基因組序列，或來自未知序列的 cDNA 克隆制備模板 cDNA，通過人工或特定的儀器將大量模板 cDNA 按設(shè)計(jì)好的順序定量地固定在載體上制備成高密度的微陣列。將標(biāo)記好的樣品 cDNA 片段（來自不同細(xì)胞、組織或整個(gè)器官）與模板上的cDNA 進(jìn)行分子雜交。根據(jù)不同材料間基因差異表達(dá)的信息，推論某個(gè)基因的功能或鑒定和分離目的基因。DNA 芯片還廣泛應(yīng)用于基因表達(dá)譜、突變基因篩選和轉(zhuǎn)基因鑒別等方面。

在西瓜上，Levi 等[4]通過與葉片cDNA消減雜交構(gòu)建了西瓜果實(shí)發(fā)育不同時(shí)期（授粉后12、24、36 d）果肉消減cDNA文庫(kù)。為進(jìn)一步探究這些EST-unigenes在果實(shí)發(fā)育不同時(shí)期的轉(zhuǎn)錄表達(dá)差異，W. Patrick Wechter等[21]利用微列陣（microarray）技術(shù)對(duì)這些EST進(jìn)行了差異表達(dá)分析，發(fā)現(xiàn)與葉片相比，有335個(gè)ESTs的表達(dá)存在明顯的差異，表達(dá)量差異至少在2倍以上。其中有211個(gè)與已知功能基因同源，96個(gè)為未知基因。這些基因參與了維管系統(tǒng)、類胡蘿卜素合成、轉(zhuǎn)錄調(diào)控、病原和逆境脅迫響應(yīng)以及乙烯合成等，實(shí)時(shí)定量PCR也驗(yàn)證了這些功能基因的差異表達(dá)。

在甜瓜上，張紅等[22]利用國(guó)內(nèi)首個(gè)甜瓜cDNA 芯片Melon cDNA array ver1.0檢測(cè)了新疆厚皮甜瓜（Cucumis melo var. ameri）果實(shí)基因表達(dá)以及經(jīng)60Co射線輻射誘變后的新疆厚皮甜瓜酸味抗病變異株成熟果實(shí)基因的表達(dá)。結(jié)果顯示，該芯片平均能夠檢測(cè)新疆厚皮甜瓜基因2 008個(gè)，檢測(cè)出的基因占該芯片基因探針總數(shù)的65.4%。發(fā)現(xiàn)酸味抗病變異株上調(diào)表達(dá)的基因有251個(gè)，占檢出基因總數(shù)的12.5%，下調(diào)表達(dá)的基因224個(gè)，占檢出基因總數(shù)的11.16%。RT-PCR重復(fù)試驗(yàn)表明用Melon cDNA array ver 1.0檢測(cè)新疆厚皮甜瓜成熟果實(shí)基因表達(dá)水平是可行的。Daniel Gonzalez-Ibeas等[23]利用抗西瓜花葉病毒甜瓜材料TGR-1551，感病材料Tendral，用DNA 芯片檢測(cè)了17 443個(gè)unigenes的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)接種感染后TGR-1551比對(duì)照發(fā)生了顯著的轉(zhuǎn)錄差異，與空白對(duì)照相比，Tendral有 3 291個(gè)unigenes 差異表達(dá)，TGR-1551有2 488個(gè)unigenes 差異表達(dá)，共有677個(gè)unigene unigenes受到抑制表達(dá)。說明TGR-1551發(fā)生了廣泛、深刻的轉(zhuǎn)錄差異。

在黃瓜上，毛偉華等[24]通過GenBank搜索已發(fā)布的生物代謝途徑中的關(guān)鍵酶基因序列， 設(shè)計(jì)特異性引物， 采用RT-PCR法擴(kuò)增這些酶的相應(yīng)基因片段，在完成432個(gè)基因片段的克隆分離、測(cè)序和生物信息學(xué)分析工作的基礎(chǔ)上研制出國(guó)內(nèi)首張黃瓜cDNA 芯片。該芯片含有9個(gè)質(zhì)控cDNA片段和423個(gè)cDNA探針， 涉及光反應(yīng)、卡爾文循環(huán)、碳水化合物代謝、水-水循環(huán)、信號(hào)傳導(dǎo)、激素代謝、光呼吸、防御、蛋白與氨基酸代謝等多個(gè)代謝途徑。利用該芯片對(duì)黃瓜缺鎂脅迫下基因表達(dá)譜進(jìn)行了初步研究， 發(fā)現(xiàn)在缺鎂脅迫下差異表達(dá)的22個(gè)基因， 其中10個(gè)基因的表達(dá)受缺鎂處理抑制， 12個(gè)基因的表達(dá)受缺鎂處理誘導(dǎo)。該芯片的研制為進(jìn)一步研究黃瓜功能基因的高通量時(shí)空變化提供了有效的技術(shù)支撐。為驗(yàn)證該套cDNA芯片雜交結(jié)果的可靠性，毛偉華等[25]研究了黃瓜在CMV 侵染脅迫下的基因表達(dá)譜變化，并對(duì)其中5個(gè)具有代表性的基因通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR（QRT—PCR）進(jìn)行檢測(cè)，共獲得67個(gè)差異表達(dá)顯著的基因，其中42個(gè)基因下調(diào)表達(dá)，25個(gè)基因上調(diào)表達(dá)。這些差異表達(dá)的基因涉及了許多重要代謝途徑，許多與光合作用、氮同化相關(guān)的基因受到明顯的抑制，而一些防御相關(guān)基因和信號(hào)傳導(dǎo)相關(guān)基因則誘導(dǎo)表達(dá)。同時(shí)，也發(fā)現(xiàn)了一些與CMV 脅迫相關(guān)的功能未知基因或未有任何功能信息的基因。研究發(fā)現(xiàn)，CMV 脅迫引發(fā)了黃瓜代謝發(fā)生一系列復(fù)雜的適應(yīng)性變化，PR1-1a 等基因可能在黃瓜防御CMV侵染過程發(fā)揮著重要作用。

4 RNAi技術(shù)

RNAi（RNA interference）是一種雙鏈RNA （double-stranded RNA，dsRNA）分子在mRNA水平關(guān)閉相應(yīng)序列基因的表達(dá)或使其沉默的過程，也就是序列特異性的轉(zhuǎn)錄后基因沉默（post-transcriptional gene silencing， PTGS）。RNAi技術(shù)具有高度的序列專一性和有效的干擾活力，可以特異地使特定基因沉默，獲得功能喪失或降低的突變體，根據(jù)表型變異可推測(cè)該基因的功能，RNAi已發(fā)展成為功能基因組學(xué)研究中基因功能鑒定的一種強(qiáng)有力的工具。

2012年，ANA M.等[26]利用RNAi技術(shù)沉默甜瓜 Cm-eIF4E（核細(xì)胞翻譯起始因子）基因，通過對(duì)轉(zhuǎn)基因T2代接種8種甜瓜易侵染的病毒，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因植株對(duì)黃瓜葉脈黃化病毒（CVYV）、甜瓜壞死斑病毒（MNSV）、摩洛哥西瓜花葉病毒（MWMV）、小西葫蘆黃花葉病毒（ZYMV）產(chǎn)生抗性，表明Cm-eIF4E的存在造成甜瓜對(duì)這4種病毒的易感染性。Cm-eIF4E基因?qū)τ谔鸸献魑飶V譜高抗等位基因的發(fā)現(xiàn)，將是一個(gè)有效的選擇途徑。程鴻等[27]通過RT-PCR 方法從甜瓜中克隆得到白粉病感病相關(guān)基因CmMLO2 的cDNA 序列，RT-PCR 結(jié)果表明，CmMLO2 主要在甜瓜葉片中表達(dá)，具有組織特異性。在受到白粉病菌脅迫時(shí)CmMLO2表達(dá)顯著上調(diào)，表明CmMLO2 很有可能與白粉病發(fā)病有關(guān)。構(gòu)建RNAi表達(dá)載體，利用葉盤轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)化甜瓜，獲得了PCR 陽(yáng)性植株，對(duì)白粉病接種鑒定結(jié)果表明，轉(zhuǎn)化植株對(duì)白粉病具有抗性，證明通過ihpRNAi敲除CmMLO2，可以獲得對(duì)白粉病具有抗性的甜瓜材料。

5 T-DNA插入突變

T-DNA（transferred DNA）是根癌農(nóng)桿菌（Agrobacterium tumefaciens）內(nèi) Ti 質(zhì)粒（tumor-inducing plasmid）上的一段 DNA， 它能侵染并穩(wěn)定地整合到植物基因組中。由于插入的 T-DNA 序列已知， 插入到植物基因組中的T-DNA 類似于給基因貼了一個(gè)序列標(biāo)簽。通過分離T-DNA 標(biāo)簽位點(diǎn)的側(cè)翼水稻基因組序列， 可以快捷地找到含有標(biāo)簽的基因， 經(jīng)過插入標(biāo)簽基因與突變體表型的共分離檢測(cè)， 從而獲得基因的生物學(xué)功能。任海英等[28]采用農(nóng)桿菌侵染子葉外植體的方法產(chǎn)生T-DNA 插入的甜瓜突變體，篩選到一個(gè)蔓枯病抗性明顯增強(qiáng)的突變體，命名為edr2，該突變體是T-DNA 單拷貝插入甜瓜染色體引起的，edr2 的蔓枯病抗性和標(biāo)記基因卡那霉素抗性基因共分離。蔓枯病菌在突變體甜瓜edr2上的侵染過程與在野生型甜瓜上相比，分生孢子萌發(fā)率降低、芽管的伸長(zhǎng)和菌絲的生長(zhǎng)較遲緩。蔓枯病菌的侵染能引起edr2突變體發(fā)生細(xì)胞程序性死亡，但是不引起野生型甜瓜的細(xì)胞發(fā)生程序性死亡。本研究為選育抗蔓枯病的甜瓜品種提供了新的思路，為挖掘甜瓜-蔓枯病菌互作的基因提供了支持。

6 展 望

西瓜[29]、甜瓜[30]、黃瓜 [31]全基因組測(cè)序已完成并對(duì)外公布，測(cè)序獲得的大量生物信息為開展功能基因組學(xué)研究奠定了基礎(chǔ)，也標(biāo)志著瓜類作物基因組研究逐步進(jìn)入到功能基因組研究時(shí)代?？梢灶A(yù)測(cè)，未來將會(huì)有更多不同類型的cDNA文庫(kù)，包括全長(zhǎng)cDNA文庫(kù)被構(gòu)建，更多的EST序列將被釋放，從而為基因芯片的開發(fā)提供更多的源序列。另外，TILLING 、T-DNA突變體庫(kù)的構(gòu)建工作也將陸續(xù)啟動(dòng)或完成，更多的功能基因?qū)⒈昏b定和分離。功能基因組研究的深入有望鑒定和分離出控制重要農(nóng)藝性狀的全部基因， 揭示基因的時(shí)空表達(dá)模式，弄清在性狀形成中基因與基因的互作，并在此基礎(chǔ)上形成對(duì)基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的認(rèn)識(shí)。屆時(shí)人們就能夠從基因結(jié)構(gòu)和基因表達(dá)調(diào)控兩個(gè)方面對(duì)基因進(jìn)行修飾，在作物育種實(shí)踐中實(shí)現(xiàn)分子設(shè)計(jì)育種，從而培育出抗逆性強(qiáng)、品質(zhì)優(yōu)良、有益人體健康的西瓜、甜瓜、黃瓜品種，滿足人們不斷增長(zhǎng)的消費(fèi)需求。

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