游離脂肪酸對(duì)糖尿病大鼠心腎病理改變的影響

王震靜等

【摘要】 目的 對(duì)雄性Wistar糖尿病大鼠外源性輸注脂肪乳，提高大鼠血液中游離脂肪酸（FFA）的濃度，觀察大鼠在不同濃度游離脂肪酸作用下，心肌細(xì)胞直徑的改變、腎小球體積的改變以及心肌和腎小球上白介素-6（IL-6）的不同表達(dá)。方法 制作糖尿病大鼠模型，按照隨機(jī)數(shù)字表編號(hào)將DM大鼠分入對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組，頸靜脈穿刺插管，在輸液前后，分別經(jīng)頸靜脈內(nèi)采血，分離血清，待檢測(cè)，實(shí)驗(yàn)結(jié)束，分離心臟及兩側(cè)腎臟，測(cè)量左側(cè)腎臟質(zhì)量，將心腎組織用4%中性甲醛固定，制作切片，進(jìn)行HE染色和免疫組化組織染色。EllisAE法檢測(cè)血清FFA，光學(xué)顯微鏡下測(cè)量各組大鼠心肌細(xì)胞直徑和腎小球面積，計(jì)算腎小球平均體積（VG）并計(jì)算腎重體重比值，測(cè)量各組的心肌和腎小球的IL-6光密度值，統(tǒng)計(jì)各組數(shù)據(jù)之間的差異是否有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義及其相關(guān)系數(shù)。結(jié)果 ①實(shí)驗(yàn)組大鼠的血清FFA水平明顯升高，比對(duì)照組升高2-4倍。實(shí)驗(yàn)組大鼠隨著脂肪乳輸注時(shí)間的增加，腎重體重比值漸變大，4天組、6天組有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，與游離脂肪酸相關(guān)系數(shù)為0.782，P<0.01。實(shí)驗(yàn)組大鼠的腎小球體積隨著脂肪乳輸注時(shí)間的增加而增加，自2天組開(kāi)始腎小球體積增大有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，與血清中游離脂肪酸相關(guān)系數(shù)為0.837，P<0.01，與腎小球IL-6的表達(dá)相關(guān)系數(shù)為0.843，P<0.01。②對(duì)照組大鼠腎小球中IL-6基本不表達(dá)或弱表達(dá)，測(cè)量其平均光密度分別為0.1612、0.1583、0.1579；實(shí)驗(yàn)組大鼠IL-6水平較對(duì)照組明顯增高，2天組、4天組、6天組光密度分別為0.2173、0.4409、0.5294，2天組開(kāi)始就有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。③心肌細(xì)胞HE染色顯示：實(shí)驗(yàn)組大鼠較對(duì)照組大鼠心肌細(xì)胞肥大，隨著脂肪乳輸注時(shí)間的延長(zhǎng)，心肌細(xì)胞直徑漸增大，4天組、6天組有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。隨著脂肪乳輸注時(shí)間延長(zhǎng)，心肌細(xì)胞局部IL-6表達(dá)增多，自2天組就有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，與FFA濃度相關(guān)系數(shù)為0.753，P<0.01，與心肌細(xì)胞局部IL-6光密度水平相關(guān)系數(shù)為0.808，P<0.01。結(jié)論 游離脂肪酸引起糖尿病大鼠腎重體重比值增加、腎小球體積增大、腎小球局部IL-6表達(dá)增加，并且隨著脂肪乳注射時(shí)間延長(zhǎng)，上述改變明顯。腎重體重比值和腎小球的改變可能與局部IL-6高表達(dá)相關(guān)。游離脂肪酸引起糖尿病大鼠心肌細(xì)胞肥大，隨著FFA濃度的增加，肥大明顯，肥大改變可能與局部IL-6表達(dá)相關(guān)。

【關(guān)鍵詞】 Wistar大鼠；糖尿??；游離脂肪酸

doi：10.3969/j.issn.1004-7484（x）.2013.06.004 文章編號(hào)：1004-7484（2013）-06-2863-02

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及糖尿病動(dòng)物模型的建立 健康雄性Wistar大鼠30只，6-8周齡，體重180-200g，由中國(guó)醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。（SPF級(jí)），普通飼料適應(yīng)性喂養(yǎng)l周，后給予高脂飲食4周。

使用前臨時(shí)配制STZ溶液。高脂飼料喂養(yǎng)4周后的大鼠，禁食12h過(guò)夜后，稱重，按照40mg/Kg，腹腔注射1%STZ一次。繼續(xù)高脂喂養(yǎng)72小時(shí)，血糖檢測(cè)，空腹血糖（FBG）≥1l.lmmol/L者為DM大鼠，有28只經(jīng)檢驗(yàn)成模，進(jìn)入實(shí)驗(yàn)。

1.2 研究對(duì)象和分組 按照隨機(jī)數(shù)字表將大鼠分入輸入生理鹽水的對(duì)照組和輸入脂肪乳的實(shí)驗(yàn)組。實(shí)驗(yàn)組繼續(xù)給予高脂飲食一周，對(duì)照組普通飼料飼養(yǎng)。

1.3 方法操作

1.3.1 大鼠頸靜脈穿刺插管手術(shù) 稱重，用3%戊巴比妥鈉（4mg/Kg）腹腔注射麻醉，暴露并分離右側(cè)頸靜脈，以PE50軟質(zhì)塑料管行頸靜脈插管，插管深度約1-2cm。遠(yuǎn)端穿過(guò)皮下固定于頸背部皮膚處。

1.3.2 靜脈輸注 經(jīng)大鼠頸背部導(dǎo)管采血后，靜脈導(dǎo)管與微量輸液裝置連接，以微量輸液泵24小時(shí)連續(xù)輸注。FFA組（n=15）：輸注20%英脫匹利特+肝素鈉（英脫匹利特：肝素鈉=lml：40UI），輸注速率0.6-1ml/h，以維持循環(huán)中FFA水平高于基礎(chǔ)值2-4倍，輸液持續(xù)2-6天（FFA-2d：n=5，F(xiàn)FA-4d：n=5，F(xiàn)FA-6d：n=5）；NS組（n=13，NS-2d，n=5，NS-4d，n=4，NS-6d，n=4）以相同速率（0.6-1.0ml/h）連續(xù)靜脈輸注生理鹽水。實(shí)驗(yàn)結(jié)束，經(jīng)頸靜脈內(nèi)采血，分離血清，于-80℃冰箱保存，測(cè)定血FFA水平。

1.4 主要試劑與儀器

1.4.1 主要儀器 ①顯微照相系統(tǒng)，日本奧林巴斯（Olympus，TurboScan）

②生物顯微照相分析系統(tǒng)，（日本Olympus，BX51）。

1.4.2 試劑 ①血清游離脂肪酸試劑盒，上海研吉生物科技有限公司；②免疫組化試劑盒一抗、二抗、DAB顯色劑均購(gòu)于北京中杉生物技術(shù)有限公司。

1.5 切片制作 分離心臟、腎臟，左側(cè)腎臟除去包膜稱重，取心臟組織，腎臟組織固定于4%的中性甲醛中，制切片，并進(jìn)行HE常規(guī)組織染色和IL-6免疫組化染色。

1.6 IL-6組織局部沉積 IL-6染色陽(yáng)性物質(zhì)為棕黃色，利用顯微圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行圖像采集，分析腎小球內(nèi)IL-6在組織局部表達(dá)的情況，可見(jiàn)對(duì)照組大鼠腎小球中IL-6基本不表達(dá)或弱表達(dá)，平均光密度分別為0.1612、0.1583、0.1579；實(shí)驗(yàn)組大鼠，腎小球中IL-6水平較對(duì)照組增高，2天組﹑4天組﹑6天組的光密度分別為0.2173、0.4409、0.5294，2天組開(kāi)始就有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

1.7 腎重體重比值和平均腎小球體積的計(jì)算 計(jì)算各對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)各組中大鼠的腎重體重比值，得出，實(shí)驗(yàn)4天組腎臟體重比值開(kāi)始有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，應(yīng)用OlympusBX51分析系統(tǒng)測(cè)定各組大鼠HE染色腎小球等效直徑和平均截面積（AG），據(jù)公式VG=l.38/1.1×AG3/2算出腎小球平均體積（VG），并計(jì)算其與游離脂肪酸的相關(guān)性，經(jīng)PEARSON分析其相關(guān)系數(shù)為0.837。

1.8 心肌細(xì)胞直徑（MCD）測(cè)定 將心肌切片在400倍光學(xué)顯微鏡下測(cè)定MCD，每張HE染色切片選取6-8個(gè)不重復(fù)的視野，每個(gè)視野測(cè)量5-10個(gè)心肌細(xì)胞，每一標(biāo)本測(cè)量50個(gè)心肌細(xì)胞，以平均值作為該樣本MCD進(jìn)行分析。在被測(cè)定的心肌細(xì)胞，在橫向上，細(xì)胞核位于細(xì)胞的中央，其最短徑線為MCD[1]。2天組開(kāi)始大鼠心肌細(xì)胞較對(duì)照組大鼠相比直增徑大。心肌細(xì)胞直徑與游離脂肪酸濃度的相關(guān)系數(shù)經(jīng)PEARSON分析為0.789，與心肌局部IL-6水平的相關(guān)系數(shù)r為0.808。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 定量結(jié)果用（χ±s）表示。采用SPSS13.0軟件進(jìn)行系統(tǒng)分析，組間比較采用t檢驗(yàn)。相關(guān)性用PEARSON相關(guān)分析，P≤0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 論

2.1 隨著脂肪乳輸注時(shí)間的延長(zhǎng)，糖尿病大鼠體內(nèi)FFA濃度增高，腎重體重比值增加、腎小球體積增大，腎小球局部IL-6的表達(dá)指標(biāo)—光密度也有增高趨勢(shì)，腎臟的體積增大可能與局部IL-6高表達(dá)相關(guān)。

2.2 隨著脂肪乳輸注時(shí)間的延長(zhǎng)，糖尿病大鼠體內(nèi)FFA濃度增高，糖尿病大鼠心肌細(xì)胞直徑變大，隨著FFA作用時(shí)間的延長(zhǎng)，肥大病變趨于明顯，且局部IL-6表達(dá)增加，說(shuō)明FFA可能引起心肌細(xì)胞肥大，并且程度與FFA濃度和持續(xù)時(shí)間呈正相關(guān)，機(jī)制可能與局部IL-6表達(dá)水平相關(guān)，見(jiàn)表1、表2。

3 討 論

動(dòng)脈粥樣硬化是糖尿病患者常見(jiàn)的并發(fā)癥，從病理生理學(xué)和流行病學(xué)的角度都能說(shuō)明糖尿病與大血管疾病的密切關(guān)系。糖尿病大血管病變?cè)诮M織病理學(xué)上與動(dòng)脈粥樣硬化并無(wú)差異，但其發(fā)生早、進(jìn)展快、預(yù)后差，糖尿病大血管疾病的發(fā)生率和病死率更高。

FFA導(dǎo)致大血管病變的機(jī)制可能為：①FFA通過(guò)對(duì)NO生成的抑制，對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞的損傷，血管內(nèi)皮功能失調(diào)是動(dòng)脈硬化的始動(dòng)因素。NO生成的減少，內(nèi)皮細(xì)胞依賴性血管舒張功能受損，將啟動(dòng)和加速動(dòng)脈粥樣硬化病理過(guò)程發(fā)生。②FFA通過(guò)增加氧化應(yīng)激產(chǎn)物損傷血管內(nèi)皮。③FFA增加導(dǎo)致脂蛋白成分異常：在膽固醇酯轉(zhuǎn)移蛋白存作用下，高密度脂蛋白、低密度脂蛋白的膽固醇和VLDL的TG交換增加，形成富含膽固醇的致動(dòng)脈粥樣硬化的VLDL和富含TG而膽固醇少的HDL、LDL。肝脂肪酶或脂蛋白酶水解富含TG的LDL，形成有著更強(qiáng)致AS作用的小而密VLDL。富含TG的HDL更易被肝脂肪酶水解而失去心血管保護(hù)作用[2]。

文中通過(guò)研究論述糖尿病大鼠腎重體重比值與腎小球體積的增大可能機(jī)制，以期待對(duì)于糖尿病腎病的發(fā)病原因做一探究，對(duì)糖尿病腎病的早期預(yù)防和治療提供依據(jù)。

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