卵黃免疫球蛋白在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中的應(yīng)用

高嵩等

摘 要 卵黃免疫球蛋白（IgY）是鳥類、兩棲類和爬行類動物的主要免疫球蛋白。IgY穩(wěn)定性好，具有不激活補體系統(tǒng)、不與類風(fēng)濕因子和蛋白A、G結(jié)合等免疫學(xué)特性，且產(chǎn)量高、易提取純化。該蛋白已廣泛應(yīng)用于獸醫(yī)學(xué)、功能食品和生物制品等方面，且在疾病預(yù)防控制和治療方面開發(fā)潛力廣闊。本文就從IgY的生物學(xué)特性，以及其在免疫診斷和免疫治療方面的應(yīng)用作一綜述。

關(guān)鍵詞 卵黃免疫球蛋白 免疫 藥理

1893年Klemperer提出母雞血清中的抗體可通過產(chǎn)卵方式傳給后代，在胚胎發(fā)育早期作為主要的免疫球蛋白為雛雞提供被動的免疫保護。因該抗體蛋白與哺乳動物IgG分子類似，故稱其為鳥類IgG。而1969年Leslie等[1]的實驗證明，鳥類IgG與哺乳動物IgG的分子不同，所以又提出了卵黃免疫球蛋白（IgY）這個概念。由于當(dāng)時IgY提取困難，故未受到重視。直到1990年后，Akita等[2]建立了水稀釋法，使IgY的提取變得簡單易行，從而掀起了IgY制備和應(yīng)用的熱潮。鑒于IgY具有產(chǎn)量高、穩(wěn)定性好、免疫學(xué)特性獨特等優(yōu)點，該蛋白被稱為最具潛力的哺乳動物抗體替代品。1996年歐洲實驗方法替換確認中心（EC-VAM）推薦使用IgY替代哺乳動物IgG。1999年出于對動物保護的考慮，IgY技術(shù)被瑞士聯(lián)邦政府接受。德國、日本、瑞典和南非等國家對IgY的研究也明顯領(lǐng)先，這些研究進展將使多克隆抗體的生產(chǎn)進入無害化、易操作的新時代，雞也被稱作新一代的抗體“加工廠”[3]。

IgY的來源和產(chǎn)量

IgY來源于雞卵黃。與哺乳動物（兔、牛等）相比，產(chǎn)蛋母雞成本低，是有效的多克隆抗體生產(chǎn)者。Li等[4]研究證實，卵黃的重量與母雞產(chǎn)蛋天數(shù)的百分比是IgY產(chǎn)量的2個重要因素。母雞初次免疫10天后，即可獲得高濃度的抗體，且效價穩(wěn)定，可持續(xù)6～28周。另外，免疫雞的飼養(yǎng)簡單，花費少，且符合3R[替代（replacing）、減少（reducing）、改善（refining）]的動物保護原則[5]。IgY在雞卵黃中的濃度約為5～20 mg/ml，每枚雞卵黃中可提純100～150mg，12枚雞卵黃約可提純1g的IgY，與100 ml血清中所含IgG的含量相當(dāng)。每只母雞每年可產(chǎn)卵280枚，即可生產(chǎn)約40 g的IgY；而每只兔每2～3周抽血1次，一年僅可生產(chǎn)1.3 g抗體，所以1只雞的年產(chǎn)蛋量所獲得的IgY可相當(dāng)于40只兔的年產(chǎn)抗體量。

理化性質(zhì)

IgY為可溶性蛋白，親水性比IgG好，且等電點較IgG低，約為5.2。IgY化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定：①耐酸性好，pH值<3時失活。②耐堿。③穩(wěn)定性好，在pH為8時，IgY與乳膠的復(fù)合物穩(wěn)定性很好，可作為制備親和層析柱純化所需蛋白。Akita等[2]使用IgY制備的親和層析柱分離乳清和初乳中的IgG，1年多使用50余次，其結(jié)合力僅略有降低。④熱穩(wěn)定性好，巴氏消毒不會使其失活，-30℃和45℃亦不能使其變性。有研究表明，高糖溶液可有效提高IgY在高溫（75～80℃）、高壓（5000kg/cm2）和低pH值（pH 3）環(huán)境中的穩(wěn)定性[6]。

免疫學(xué)特性

Kronvall等[7]和Akerstrom等[8]分別證明，IgY不與蛋白A和蛋白G結(jié)合，是單克隆抗體和多克隆抗體檢測的有力工具。20世紀90年代，研究者又發(fā)現(xiàn)IgY的其他免疫學(xué)特性：①不與類風(fēng)濕因子結(jié)合。類風(fēng)濕因子是一種自身抗體，可與IgG的Fc片段結(jié)合，產(chǎn)生假陽性反應(yīng)。類風(fēng)濕因子的干擾使免疫測定中易產(chǎn)生交叉反應(yīng)。Larsson等[4]利用夾心ELSIA證明，類風(fēng)濕因子不與IgY結(jié)合，使用IgY作免疫檢測可避免假陽性。②不激活補體系統(tǒng)。新鮮的血清樣品均含未激活的補體系統(tǒng)，通常IgG會激活補體系統(tǒng)，激活的補體組分與抗體結(jié)合，阻礙了抗體結(jié)合表位。而IgY則不激活補體系統(tǒng)，使用IgY可避免補體系統(tǒng)對固相免疫測定的干擾[4]。③不結(jié)合細菌和哺乳動物細胞表面Fc受體，使得IgY在雙重免疫組化方面比IgG更具優(yōu)勢[9]。④與IgG幾乎無交叉反應(yīng)，常用于循環(huán)復(fù)合物的測定[10]。⑤使用少量抗原即可產(chǎn)生大量抗體。高度保守的哺乳動物蛋白在兔中不能引起免疫應(yīng)答，但在鳥類中卻很容易獲得抗這些蛋白的抗體。對各種哺乳動物的抗原均有效，如總量30～475μg增殖細胞核抗原可產(chǎn)生雞抗弱免疫原性RNA多聚酶Ⅱ的抗體[11]。

IgY在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中的應(yīng)用

IgY在人類醫(yī)學(xué)、獸醫(yī)學(xué)、食品科技和生物制劑等方面應(yīng)用廣泛。IgY可作為特異抗體已成為醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中新的研究熱點[12～14]。

IgY在疾病相關(guān)蛋白檢測中的應(yīng)用：血漿白蛋白（HSA）和IgG等10種高濃度蛋白約占血漿總蛋白的90%，由于部分低濃度蛋白很可能是癌癥、心肌梗塞等重大疾病的關(guān)鍵指示分子。如何祛除高濃度蛋白，檢出低濃度蛋白，在疾病的早期診斷和療效考核中具有重要意義。制備抗HSA和IgG的雞卵黃抗體（IgY），金磁微粒載體固定，可特異結(jié)合HSA和IgG，以便除去血漿中大部分的HSA和IgG，使低豐度蛋白富集，有效提高低豐度蛋白的檢出率，這為血漿蛋白質(zhì)組學(xué)研究提供了一種新的方法[15]。Hb BartS胎兒水腫綜合征是最嚴重的一種α型地中海貧血病。從該病患者的紅細胞溶解液中提取γ鏈四聚體（γ4，Hb BarttS），免疫雞獲得特異IgY抗體，該抗體可特異結(jié)合γ球蛋白、Hb BarttS和血紅蛋白F，用直接ELISA檢測336份人紅細胞溶血產(chǎn)物，其敏感性高達100%，特異性為96%，比傳統(tǒng)滲透脆性試驗法的特異性（約86%）高。該方法的建立有利于在地中海貧血病流行的國家簡單快速的檢測α型地中海貧血病[16]。

IgY在病原體檢測中的應(yīng)用：療效考核是目前日本血吸蟲病免疫診斷的瓶頸，建立有效的評價方法是寄生蟲學(xué)界廣泛關(guān)注的問題[17]。近兩年已有研究者使用IgY以改進血吸蟲病免疫診斷方法。即用純化的抗可溶性蟲卵抗原（SEA）的IgY為捕捉抗體，以酶標(biāo)抗SEA單克隆抗體為檢測抗體的雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附試驗（S-ELISA）檢測急性血吸蟲病患者、慢性血吸蟲病患者和健康人的血清，其中急性血吸蟲病患者和慢性血吸蟲病患者的血清循環(huán)抗原的陽性率分別為100%（9/9）和84.4%（38/45），特異性為96%（48/50）[18]。而常用的間接血清凝集試驗（IHA）的敏感性和特異性分別為69.6%和89.4%[19]。可見前者比后者更具敏感性和特異性，為解決血吸蟲病療效考核的問題帶來了希望。

IgY在胃腸道疾病中的應(yīng)用：最新研究顯示，通過口服抗菌抗體或抗病毒抗體可替代抗生素藥物而有效預(yù)防胃腸道感染。但傳統(tǒng)的抗體生產(chǎn)工藝復(fù)雜，價格昂貴。而IgY因其來源便宜、易制備、穩(wěn)定性好、耐酸和耐胃蛋白酶等優(yōu)點成為制備口服抗體的最佳選擇。如輪狀病毒是致嬰幼兒秋冬季腹瀉的主要病原體，全球每年約有100萬兒童患輪狀病毒性腹瀉，至今尚缺乏有效的治療手段。新藥百貝寧主要成分是抗輪狀病毒抗體（IgY），治愈率高達88.9%，在臨床應(yīng)用中未發(fā)現(xiàn)有不良反應(yīng)[20]。

IgY在呼吸道傳染病中的應(yīng)用：Nilsson等[21]在瑞典對17例膽囊纖維癥患者給予口服IgY以預(yù)防銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa），通過長達12年的觀察，發(fā)現(xiàn)17人中僅有2人有銅綠假單胞菌慢性植入情況，而對照組23人中卻有7人。所有試驗組患者肺功能均正常，且身體質(zhì)量指數(shù)正常或接近正常。表明抗銅綠假單胞菌的特異IgY能有效預(yù)防銅綠假單胞菌引起的呼吸道傳染病。

IgY在免疫治療中的應(yīng)用：因雞抗體耐酸、耐熱且性能穩(wěn)定，可經(jīng)口服用于預(yù)防或治療年幼動物或人類的腸道傳染病，如嬰兒防病食品、齲齒預(yù)防、新生乳豬致死性大腸桿菌感染的預(yù)防以及魚病治療等。特別是抗生素或其他藥物的使用存在問題時，IgY成為首選。在非典流行期間，雞卵黃抗體還被研制用于抑制SARS病毒。

在人類保健上的應(yīng)用：大量研究結(jié)果顯示，雞IgY對病原體感染的防御無動物的種屬差異，故應(yīng)用雞高免IgY防治嬰幼兒疾病是完全可行的。隨著SPF雞群的使用，用卵黃研制安全可靠的人用抗?。ㄓ绕涫悄c道疾?。┥镏破繁貙@得廣泛的應(yīng)用。由修正藥業(yè)生產(chǎn)的口服免疫球蛋白——修正修修愛優(yōu)爾膠囊，其主要有效成分即為免疫球蛋白，且含量高，每100g中含有19.8gIgG，，對提高免疫力低下人群的抵抗力具有很好的效果。

中毒解救：針對蛇毒、蜘蛛毒等生物毒素的lgY與藥物開發(fā)已開展多年。王桂平等[22]使用嗜硫色譜法提純抗眼鏡蛇王毒素lgY，在小鼠試驗中，體外6mglgY中和4LD50毒素（約1.6mg/kg），體內(nèi)可有效中和約3LD50毒素（約1.2mg/kg）。Paul等[23]使用免疫親和層析純化抗蝰蛇毒素lgY，對小鼠進行皮下注射免疫保護試驗，可中和2LD50毒素，保護率為100%。Meenatchisundara等[24]制得純化的抗蝰蛇毒素lgY和鱗狀蝮蛇毒素lgY，能夠中和蝰蛇和鱗狀蝮蛇毒素，同時有抑制水腫、減少溶血和降低磷脂酶活性的作用。De Almeida等[25]使用抗非洲蝰蛇和眼鏡蛇毒素的lgY，1440μg的lgY能夠中和62.2LD50的毒素，同時使用抗毒液的lgY幾乎沒有免疫副作用。

結(jié)語和展望

經(jīng)過20多年的發(fā)展，IgY已在世界范圍引起重視。國內(nèi)外研究文獻數(shù)量不斷增多，IgY的應(yīng)用也日益廣泛。特異IgY的制備為治療和診斷各類疾病提供了新的思路。在免疫診斷方面，IgY是傳統(tǒng)哺乳動物抗體最好的替代品，它改進了現(xiàn)代免疫診斷檢測方法，已在蛋白質(zhì)印跡分析、免疫組化、膠體金標(biāo)記和免疫電泳等檢測方法中廣泛應(yīng)用。在免疫治療方面，IgY是抗生素藥物最好的替代品，在尋找藥物靶位和腫瘤治療中應(yīng)用前景廣闊，但在目前均處于實驗研究階段，距臨床應(yīng)用還較遙遠。但相信，IgY憑借其自身優(yōu)勢，將會在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中發(fā)揮更大的作用。

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