關于優(yōu)良生防菌株篩選的探討

李娜 劉錦霞

摘 要：目的：測定7種生防微生物菌種室內(nèi)毒力和比較室外小區(qū)防治同翅目昆蟲溫室白粉虱和桃蚜。方法：首先制備各種菌株發(fā)酵液，以溫室白粉虱和桃蚜為研究對象，測定各種菌株發(fā)酵液對溫室白粉虱和桃蚜這兩種害蟲的殺毒能力。結論：蠟蚧輪枝菌L-31、L-05和粉虱座殼孢F-85在離體條件下對溫室白粉虱和桃蚜均表現(xiàn)出很強的殺滅毒力，校正累計死亡率（%）均在90%左右，與其它菌種間存在顯著性差異；粉虱座殼孢對兩種害蟲的毒力較高，但室外防效不理想；蘇云金芽孢桿菌Bt1、Bt2和球孢白僵菌Q-55、Q-27對溫室白粉虱和桃蚜的毒力較弱。

關鍵詞：溫室白粉虱 桃蚜 高毒力 生防微生物

中圖分類號：S433 文獻標識碼：A 文章編號：1672-3791（2013）03（a）-0159-02

近年來，國外的研究主要集中于生物防治[1]，從植物病害防治的角度來講，生物防治就是利用生物及其代謝產(chǎn)物防治植物病害，控制病原物的方法。它的實質(zhì)就是利用生物種間關系、種內(nèi)關系，調(diào)節(jié)有害生物種群密度，即利用生物群防治生物群[2]。而國內(nèi)的科研人員也開始大力開展微生物農(nóng)藥，生防微生物菌種也開始被很多科研人員看重并作出了一些相關報道，但關于現(xiàn)在研究最多的蘇云金芽孢桿菌、球孢白僵菌、蠟蚧輪枝菌等菌種對溫室白粉虱和桃蚜的高毒力作用對比篩選較少[3]。本文選取對同翅目昆蟲溫室白粉虱和桃蚜有較高毒力的生防菌種為研究對象，其中在甘肅省科學院生物實驗基地進行溫室白粉虱的小區(qū)防效試驗，在甘肅省榆中縣和平鄉(xiāng)進行桃蚜的小區(qū)防效試驗，為拓寬生防微生物的抗蟲譜和進一步生產(chǎn)應用提供科學依據(jù)。

1 試驗材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 菌株

蘇云金芽孢桿菌Btl和Bt2，球孢白僵菌Q-55、Q-27，粉虱座殼孢F-85，蠟蚧輪枝菌L-31和L-05均購于中國微生物菌種保藏中心，經(jīng)實驗室活化、蟲體復壯后的保存菌株，灰霉病病原菌由實驗室從一品紅病葉上分離純化而得。

1.1.2 培養(yǎng)基

細菌斜面培養(yǎng)基：牛肉膏0.8 g、酵母膏0.5 g、葡萄糖1.0 g、瓊脂粉1.2 g、用蒸餾水定溶至l00 ml，調(diào)pH值為7.0。

細菌發(fā)酵培養(yǎng)液：蛋白胨5.0 g、酵母膏0.5 g、葡萄糖1.0 g、Na2HpO4.1.1 g、用蒸餾水定溶至100 ml，pH值為7.0。

真菌斜面培養(yǎng)基：酵母膏l(xiāng).0 g、蛋白胨1.0 g、葡萄糖4.0 g、瓊脂粉1.2 g，用蒸餾水定溶至l00 ml，調(diào)pH值為6.5。

真菌發(fā)酵培養(yǎng)液：酵母膏1.0 g、蛋白胨1.0 g、葡萄糖3.0 g、麥芽提取物1.0 g、KH2PO4 0.3 g、MgSO4·7H2O 0.15g，用蒸餾水定溶至100 ml，調(diào)pH值為6.5。

1.2 試驗方法

1.2.1 單菌斜面菌種的培養(yǎng)

將活化或復壯的原菌種轉接于優(yōu)選的單菌斜面培養(yǎng)基上，真菌25 ℃恒溫培養(yǎng)15天。細菌30 ℃恒溫培養(yǎng)50小時備用。

1.2.2 各試驗菌株發(fā)酵液的制備

將培養(yǎng)了足夠時間且已經(jīng)生成大量孢子或芽孢的斜面菌株用相應液體培養(yǎng)基（5毫升/支）洗下，以7%接種量分別接于相應的液體發(fā)酵培養(yǎng)基中，發(fā)酵培養(yǎng)液裝量為500 ml錐形瓶中裝l00 ml發(fā)酵培養(yǎng)液，25±0.5 ℃恒溫靜止培養(yǎng)12天；細菌30 ℃恒溫培養(yǎng)50小時。取各菌株發(fā)酵液1 ml測定其含孢量和含菌量，再各取200 ml以6000 r/mim的轉速離心，取其上清液后與剩余原發(fā)酵液一起保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 各試驗菌株的室內(nèi)殺蟲毒力測定

（1）各試驗菌株以溫室白粉虱若齡幼蟲為試蟲的室內(nèi)殺蟲毒力測定將制備的各菌株的發(fā)酵液及其離心上清液各取l0 ml，用1%吐溫水溶液（無菌）稀釋10倍后備用?？瞻讓φ沼?%吐溫水溶液（無菌）。從溫室選取溫室白粉虱危害嚴重，若齡幼蟲比較集中的兩年生一品紅植株50盆供該實驗用。

將帶有溫室白粉虱若齡幼蟲較多的一品紅葉片摘下（要求幼蟲數(shù)在30個以上），記錄其上的實際蟲頭數(shù)并將卵用小鑷子輕輕剝離，然后用浸濕透的棉花團將葉柄包裹，外用保鮮膜包扎，置于鋪有兩層干濾紙的12 cm平皿中，葉面向下，葉背向上，將準備好的各菌株稀釋發(fā)酵液分別用小噴壺噴于備好的試驗葉片上，每個備處理葉片分三次噴施，中間間隔1.5個小時，每次噴施藥量約5～6 ml，共用20 ml。處理完后將平皿用帶微孔的保鮮膜封口，置于溫箱中，每日光照10 h、黑暗14 h，25±0.5 ℃恒溫培養(yǎng)，每處理藥劑做5個重復。24 h后每天用滴管滴入9～10滴無菌水（以保持小環(huán)境的適宜濕度確保一品紅葉片新鮮和各生防菌萌發(fā)浸染）。每種試驗藥劑包括對照均做5個重復。每天記錄死亡蟲頭數(shù)，連續(xù)7天。記錄累計死亡蟲頭數(shù)，計算校正累計死亡率，并對試驗數(shù)據(jù)用D.B.Duncan新復極差法做統(tǒng)計分析，比較各試驗菌株的毒力差異性。

（2）各試驗菌株對桃蚜的室內(nèi)殺蟲毒力測定。

將制備的菌株發(fā)酵液及其離心上清液各取l0 ml，用1%吐溫水溶液（無菌）稀釋10倍后備用?？瞻讓φ沼?%吐溫水溶液（無菌）。在桃蚜危害較重的溫室中，采集成蚜比較集中的菠菜葉以及新鮮無蟲害的嫩葉適量（試蟲和飼養(yǎng)用嫩葉的采集量視當日的實驗量定，用多少采多少）帶回實驗室備用。

用軟毛筆尖將桃蚜輕輕挑入墊有兩層濾紙的直徑12 cm的培養(yǎng)皿中，每處理用桃蚜180頭以上，將各試驗菌株發(fā)酵液和對照，各取100 ml分五次（中間間隔30 min）輕輕噴到培養(yǎng)皿中。然后，用毛筆將處理后爬動自如的桃蚜輕輕挑入干凈培養(yǎng)皿（直徑7.5 crn）的新鮮菠菜嫩葉上，每皿25頭，每處理重復5次，然后將各個處理的小培養(yǎng)皿放入直徑12 cm的大培養(yǎng)皿中，大培養(yǎng)皿中盛適量無菌水用以保濕，各處理皿口用刺有小孔的保鮮膜覆蓋，置22 ℃左右的敞亮房間中飼養(yǎng)。每天觀察1次，記錄死亡蟲頭數(shù)并及時將若蚜移出，隔天更換大皿中的無菌水（保證小環(huán)境的相對無菌和適宜濕度），連續(xù)觀察7天，記錄累計死亡蟲頭數(shù)，計算校正累計死亡率，并對試驗數(shù)據(jù)用D.B.Duncan新復極差法做統(tǒng)計分析，比較各試驗菌株的毒力差異性。

1.2.4 各試驗菌株發(fā)酵液對溫室白粉虱的小區(qū)防效試驗

將制備的菌株發(fā)酵液各取200 ml，用1%吐溫水溶液稀釋10倍備用。空白對照用1%吐溫水溶液。

在栽培一品紅的溫室里，選取溫室白粉虱危害比較嚴重的二年生且正要開花的一品紅植株240株，平均分成8個長方形小區(qū)，7個為試驗藥品小區(qū)，1個為空白對照小區(qū)，各小區(qū)之間加保護行，每小區(qū)試驗植株30株，隨機取12株，每株選三片（從植株上、中、下三個位置選?。┫x數(shù)較多的葉片記錄基礎蟲數(shù)并掛牌標記，然后，同時噴施實驗藥品和清水.從葉片兩面噴施，以葉片滴水為度。施藥后的前兩天遮陰、保濕，并于施藥后第3、5、7、15天觀察記錄標記葉片的活蟲數(shù)及其有無藥害。計算蟲校正蟲口減退率。并對試驗數(shù)據(jù)用D.B.Duncan新復極差法進行統(tǒng)計分析，比較各試驗菌株發(fā)酵液對溫室白粉虱田間防效的差異顯著性。

1.2.5 各試驗菌株發(fā)酵液對桃蚜的小區(qū)防效試驗

將寄主換為嫩菠菜，并在其上接種適量桃蚜若蟲，10天后分小區(qū)進行試驗，其余實驗方法和數(shù)據(jù)記錄分析同上。

2 結果與分析

2.1 各試驗菌株的室內(nèi)殺蟲毒力（表1）

室內(nèi)毒力測定結果顯示，不同種類的生防菌種對溫室白粉虱若齡幼蟲和桃蚜的殺蟲毒力有明顯差異。粉虱座殼孢和蠟蚧輪枝菌發(fā)酵液對兩種害蟲的毒力最強，7天后的校正累計死亡率（%）均在90%左右，與其它菌種間存在顯著性差異。而球孢白僵菌和蘇云會芽孢桿菌發(fā)酵液相對較弱，七天后的校正累計死亡率（%）在80%～60%之間，其中蘇云金芽孢桿菌對兩種害蟲的殺蟲毒力最弱。

2.2 各試驗菌株發(fā)酵液對溫室白粉虱和桃蚜的小區(qū)防治效果

表2和表3的結果顯示，七株生防菌株發(fā)酵液對溫室白粉虱和桃蚜的防治效果基本一致，兩株蠟蚧輪枝菌對兩種害蟲的小區(qū)防治效果最強，防治高峰期的校正蟲口減退率（%）均可達80%以上，與其它試驗菌株之間差異顯著。

3 討論與總結

（1）通過室內(nèi)毒力測定和室外小區(qū)防效試驗比較可知，蠟蚧輪枝菌的兩個菌株在離體條件下無論是發(fā)酵液還是代謝產(chǎn)物對同翅目昆蟲溫室白粉虱和桃蚜均表現(xiàn)出很強的殺滅毒力，而且能在非寄主作物上定殖而且對目標害蟲表現(xiàn)出較好的防治效果，具有很高的開發(fā)應用潛力[3]。

（2）粉虱座殼孢對這兩種害蟲的毒力也很高，但室外防效不很理想，主要原因是菌株F-85本身的抗性較弱以及其代謝產(chǎn)物的毒力不足造成的，只要選對了菌株應該也是這兩種害蟲比較理想的生防菌。

（3）球孢白僵菌和蘇云金芽孢桿菌對同翅目昆蟲的毒力較弱，尤其蘇云金芽孢桿菌對其基本無效，單獨使用價值不高，但從它們的代謝產(chǎn)物毒力分析，與其它生防物質(zhì)復配擴大其抗蟲譜也是一種應用途徑。

參考文獻

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[3] 馬瑞燕，孔維娜，郝利軍.溫室白粉虱對幾種園藝植物的偏好性[J].昆蟲知識，2005，42（3）：301-304.

[4] 花冬梅.冬季溫室白粉虱的發(fā)生與防治[J].植物醫(yī)生，2003，16（6）：11-16.