快速培養(yǎng)法應(yīng)用與熒光定量PCR檢測肺炎支原體

楊葵 蘭俊

【摘 要】目的：探討肺炎支原體快速培養(yǎng)法及熒光定量PCR在支原體感染早期快速診斷中的價值。方法：對我院呼吸內(nèi)科及兒科216例疑似肺炎支原體感染的初診患者同時進(jìn)行肺炎支原體快速培養(yǎng)法和熒光定量PCR檢測，并結(jié)合臨床診斷及咽拭子真菌培養(yǎng)結(jié)果分析兩種方法的臨床應(yīng)用價值。結(jié)果：216例患者咽拭子肺炎支原體快速培養(yǎng)陽性率為17.2%，熒光定量PCR法檢出肺炎支原體陽性率為15.3%，兩種方法檢測肺炎支原體感染率無明顯差異（P >0.05） ；兒童與成人肺炎支原體感染率無明顯差異（P >0.05）。結(jié)論：熒光定量PCR方法特異性強(qiáng)，敏感性高，早期診斷意義較大， 但是需要貴重儀器設(shè)備且操作復(fù)雜，其缺點(diǎn)不太適合一般實驗室廣泛推廣?？焖倥囵B(yǎng)法具有方便、簡單、準(zhǔn)確，且可以用于早期檢測等優(yōu)點(diǎn)，尤其適用于不易靜脈血抽的新生兒和危重病人，但要排除真菌引起的假陽性，同時臨床需提高對成人肺炎支原體感染的重視。

【關(guān)鍵詞】肺炎支原體；快速培養(yǎng)法；熒光定量PCR

肺炎支原體（Mycoplasma pneumonia， M P）是介于細(xì)菌與病毒之間的一種病原體微生物。在已發(fā)現(xiàn)的8種類型對動物致病的支原體中，只有肺炎支原體肯定對人致病。MP是兒童及成人呼吸道感染的主要病原體之一，是社區(qū)獲得性肺炎的重要病原[1]。MP主要引起呼吸系統(tǒng)疾病，由口、鼻分泌物經(jīng)空氣傳播，常為散發(fā)，也有小流行，自20世紀(jì)90年代以來，MP感染有逐年增多的趨勢。據(jù)文獻(xiàn)報道中國MP感染率在流行高峰期可達(dá)33%～35%[2]，國外可高達(dá)50%。主要見于兒童和青少年，也可見于成人，秋冬季較多。除直接導(dǎo)致呼吸道感染（咽炎、支氣管炎及肺炎）外，MP尚可通過血行播散或免疫途徑引起腦炎、腎炎及心肌炎等多種肺外并發(fā)癥，嚴(yán)重威脅患者身體健康。因此，兒童及成人呼吸道感染時檢測MP，對臨床診斷和治療均具有非常重要的意義。本研究對2011年12月至2012年12月瀘州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院就診患者同時進(jìn)行快速培養(yǎng)法及熒光定量PCR法檢測，現(xiàn)將結(jié)果報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集我院2011年12月至2012年12月期間住院部就診患者的咽拭子標(biāo)本，其中男119例，

女97例，兒童113例，成人103例。

1.2 試劑與儀器 肺炎支原體快速鑒定培養(yǎng)基由鄭州安圖綠科生物工程有限公司提供；PCR試劑由達(dá)安基因有限公司提供，PCR儀器為ABI7500fast熒光定量PCR儀。

1.3 方法 用無菌生理鹽水浸過的棉拭子直接擦拭咽后壁，每位患者采集三個咽拭子標(biāo)本。一份咽拭子作肺炎支原體快速培養(yǎng)：用加樣槍取100ul無菌培養(yǎng)基液加入陰性對照孔，將采集到的咽拭子標(biāo)本置于培養(yǎng)基瓶內(nèi)攪動數(shù)次，取出已擠盡液體的棉拭子棄之，再用加樣槍取該培養(yǎng)液100ul分別加于每孔（陽性孔和藥敏孔），并每孔滴加液體石蠟一滴后蓋上蓋，置于37℃恒溫箱中培養(yǎng)24-48h觀察結(jié)果，培養(yǎng)液由桔紅色變成黃色為陽性，培養(yǎng)液保持桔紅色不變?yōu)殛幮?。一份咽拭子用于PCR檢測，檢測時嚴(yán)格按說明書操作。另一份標(biāo)本做咽拭子真菌培養(yǎng)。快速培養(yǎng)和PCR結(jié)果出來后立即與臨床診斷進(jìn)行比較。

1.4 統(tǒng)計分析 用SPSS10.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析，計數(shù)資料以百分比表示，用卡方檢驗，比較用t檢驗，P>0.05為無顯著性差異。

2結(jié)果

2.1 216例疑似MP感染患者，咽拭子肺炎支原體快速培養(yǎng)陽性37例（陽性率17.2%），熒光定量PCR技術(shù)陽性33例（陽性率15.3%），如以PCR法為“金標(biāo)準(zhǔn)”，快速培養(yǎng)方法的敏感性、特異性、陽性預(yù)測值（PPV）、陰性預(yù)測值（NPV）分別為86.5%（32/37）、99.4%（178/179）、97.0%（32/33）、97.3%（178/183）。兩種方法檢測肺炎支原體感染陽性率比較無顯著性差異（P>0.05），見表1。

216例患者中被確診為MP感染者41例，快速培養(yǎng)法與熒光定量PCR法的臨床符合率分別為94.6%和93.9%。

2.2 在113例兒童中被確診為MP感染22例（陽性率19.5%），103例成人中被確診為MP感染19例（18.4%）。兩個年齡階段MP感染陽性率無顯著性差異（P>0.05），見表2。

3討論

肺炎支原體是造成呼吸道感染的主要病原體，目前檢測MP的主要診斷方法包括分離培養(yǎng)、血清學(xué)和分子生物學(xué)方法。分離培養(yǎng)法是MP鑒定的金標(biāo)準(zhǔn)，MP快速培養(yǎng)法操作簡便價格低廉，對實驗室條件要求不高，且咽拭子采集標(biāo)本無創(chuàng)傷性，為MP感染的早期診斷提供了一個有效的方法。MP抗體檢測法是常用的血清學(xué)方法，其最佳檢測時間為臨床癥狀出現(xiàn)后7～10 d（窗口期），抗體10 ～30 d達(dá)高峰，12～16周又轉(zhuǎn)陰，故12周后血清MP-IgM多為陰性[3]。雖然MP-IgM抗體特異性高，但一些免疫缺陷或免疫系統(tǒng)尚未發(fā)育完善的患兒不能對病原體產(chǎn)生正常的免疫應(yīng)答，在MP感染的情況下也不能產(chǎn)生MP-IgM抗體；其次，MP感染后，高滴度抗體可在感染后保持?jǐn)?shù)月，從而難以區(qū)別現(xiàn)癥感染與既往感染。國內(nèi)外針對MP的分子生物學(xué)方法主要以聚合酶鏈反應(yīng)即PCR為主。PCR方法特異性強(qiáng)，敏感性高，早期診斷意義較大，但由于受實驗條件及設(shè)備的限制，不易普及開展。

本實驗肺炎支原體快速鑒定培養(yǎng)基為一種人工合成液體培養(yǎng)介質(zhì)，其組成材料是根據(jù)肺炎支原體結(jié)構(gòu)繁殖增生下所需要營養(yǎng)成分而合理配置的一套蛋白質(zhì)、磷脂、碳水化合物、膽固醇、微量元素及復(fù)合抑菌因子等混合而成的營養(yǎng)豐富、特異性強(qiáng)的專用培養(yǎng)基，其機(jī)理是快速繁殖增長的肺炎支原體分解葡萄糖產(chǎn)酸使培養(yǎng)基PH降低，產(chǎn)生顏色變化來判斷肺炎支原體生長，標(biāo)本中其他細(xì)菌因培養(yǎng)基中加入了青霉素、醋酸鉈和生物抑菌劑等被抑制[4]。而熒光定量PCR方法是近年來興起的檢測肺炎支原體的新方法。據(jù)報道[5]，實時熒光定量PCR的假陽性非常少見。我們運(yùn)用了達(dá)安基因有限公司提供的熒光定量試劑盒對肺炎支原體DNA進(jìn)行檢測，取得滿意效果，這一方法準(zhǔn)確可靠。但是需要貴重儀器設(shè)備且操作復(fù)雜，其缺點(diǎn)不太適合一般實驗室廣泛推廣。

MP肺炎主要的臨床表現(xiàn)是：起病可急可緩，可有發(fā)熱，熱型不定。開始咳嗽為干咳，后轉(zhuǎn)為頑固性劇烈咳嗽，有時表現(xiàn)百日咳樣咳嗽，也有少數(shù)患兒表現(xiàn)為偶咳甚至不咳。MP肺炎X線（住院DR）表現(xiàn)可各不相同，按其侵潤范圍主要有以下三種：①以間質(zhì)為主的表現(xiàn)為肺紋理增粗、模糊，網(wǎng)點(diǎn)狀陰影，同時伴有肺紋模糊，結(jié)構(gòu)紊亂。②小葉性肺炎的表現(xiàn)，為斑片狀陰影和云絮狀密度增高影。③肺段實質(zhì)侵潤，表現(xiàn)為累及1-2個肺段的大片狀致密影，呈三角形或扇形，邊緣清晰，自肺門向肺野分布的大片狀陰影密度較淡，邊緣模糊，內(nèi)可見肺紋理[6]。若患者有上述臨床表現(xiàn)和X線表現(xiàn)，臨床醫(yī)生可明確診斷MP感染。本研究中，216例患者中被確診為MP感染者41例，快速培養(yǎng)法與熒光定量PCR法的臨床符合率分別為94.6%和93.9%。

從表1結(jié)果顯示：快速培養(yǎng)法肺炎支原體的陽性率（17.2%）與熒光定量PCR法的肺炎支原體陽性率（15.3%）相比，無顯著差異性（P>0.05）。研究顯示：肺炎支原體快速培養(yǎng)法與熒光定量PCR法結(jié)果一致性較好，符合文獻(xiàn)報道[7-9]。已有研究發(fā)現(xiàn)[10]快速培養(yǎng)法具有操作簡便、快速、敏感等優(yōu)點(diǎn)，對臨床診斷治療有非常好的指導(dǎo)作用.無需特殊設(shè)備與儀器。本研究如以熒光定量PCR法為“金標(biāo)準(zhǔn)”，快速培養(yǎng)方法的敏感性、特異性、陽性預(yù)測值（PPV）、陰性預(yù)測值（NPV）分別為86.5%（32/37）、99.4%（178/179）、97.0%（32/33）、97.3%（178/183），表明快速培養(yǎng)法的敏感性和特異性較高，適合各級醫(yī)院MP的早期診斷，且快速培養(yǎng)法具有方便、簡單、準(zhǔn)確，且可以用于早期檢測等優(yōu)點(diǎn)，尤其適用于不易抽靜脈血的新生兒和危重病人。

從表2結(jié)果顯示：兒童與中老年肺炎支原體感染陽性率無明顯差異。MP感染主要見于兒童和青少年，通過本研究顯示成人肺炎支原體感染率在本地區(qū)相對有所上升，不可忽視。因此對于國內(nèi)許多報道的肺炎支原體感染以兒童為主并不全面，忽略了成人肺炎支原體感染.從而導(dǎo)致肺炎支原體感染后不能及時對癥治療致使肺炎支原體感染后引起心肌炎、腎炎等肺外疾病臨床頻頻發(fā)生。為此臨床科室應(yīng)將肺炎支原體感染的成人與感染肺炎支原體的兒童給予相同重視，及早診斷與治療，以預(yù)防肺炎支原體肺外感染疾病。

有1例快速培養(yǎng)法陽性的患者，其血平板培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)真菌，文獻(xiàn)報道快速培養(yǎng)時真菌污染會導(dǎo)致假陽性的結(jié)果[11-12]，該患者反復(fù)發(fā)熱，伴咳嗽，住院DR示雙肺間質(zhì)性改變、雙肺多發(fā)感染灶，被臨床確診為MP感染，這說明了該例患者為MP和真菌的混合感染。為了排除真菌引起的MP快速培養(yǎng)假陽性，我們在做MP快速培養(yǎng)的同時，應(yīng)該要做咽拭子真菌培養(yǎng)，并與臨床相結(jié)合，避免因真菌引起的假陽性所造成的誤診，為臨床醫(yī)生提高診斷肺炎支原體肺炎診治率提供可靠的檢驗依據(jù)。

綜上所述，快速培養(yǎng)法和熒光定量PCR法檢測MP感染率無明顯差異，熒光定量PCR方法特異性強(qiáng)，敏感性高，早期診斷意義較大， 但是需要貴重儀器設(shè)備且操作復(fù)雜，其缺點(diǎn)不太適合一般實驗室廣泛推廣。快速培養(yǎng)法具有方便、簡單、準(zhǔn)確，且可以用于早期檢測等優(yōu)點(diǎn)，尤其適用于不易抽靜脈血的新生兒和危重病人，但要排除真菌引起的假陽性，同時臨床需提高對成人肺炎支原體感染的重視。

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