冬蟲夏草抑制肝纖維化的臨床研究

盧靜波 周曉輝

【摘 要】目的：探討冬蟲夏草的抗肝纖維化作用機制。方法：將80例患有慢性肝纖維化的患者分為對照組和治療組，在常規(guī)護肝治療基礎上，治療組40 例患者給予冬蟲夏草口服液12周，觀察兩組治療前后肝功能指標和肝纖維化指標；通過肝穿刺后免疫印跡技術檢測CollagenⅠ、CollagenⅢ和MMP-13的變化。結果：兩組治療后肝功能均明顯改善；治療組治療后肝纖維化指標明顯低于對照組治療后；兩組治療后CollagenⅠ和CollagenⅢ顯著降低，MMP-13顯著增加，但CCF治療組改善更顯著。結論：冬蟲夏草通過降低CollagenⅠ和CollagenⅢ，提高MMP-13起到抗肝纖維化的作用。

【關鍵詞】肝纖維化；冬蟲夏草；膠原；基質金屬蛋白酶-13

肝纖維化（Hepatic fibrosis）是機體對慢性肝損傷的一種修復反應，是一種漸進的病理過程，是慢性肝病的共有病理變化。肝纖維化的特征改變是肝臟內細胞外基質（ Extracellular matrix， ECM）的過度增生和異常沉積，嚴重者的肝纖維化可導致肝硬化，甚至引起肝功能衰竭[1]。目前從肝纖維化發(fā)生發(fā)展的不同環(huán)節(jié)入手研制了許多抗纖維化藥物，但仍未有十分確定。因此，尋找理想的抗肝纖維化藥物及有關肝纖維化發(fā)病機制的闡明，具有重要的理論和臨床意義。

冬蟲夏草（Chinese Caterpillar Fungus，CCF）是從是麥角菌科真菌冬蟲夏草寄生在蝙蝠蛾科昆蟲幼蟲上的子座及幼蟲尸體的復合體，研究顯示冬蟲夏草有防止肝纖維化的作用[2]，但其作用機制未完全明確。本研究從通過臨床試驗探討冬蟲夏草抗肝纖維化的作用機理，為冬蟲夏草的臨床防治肝纖維化提供指導。

1 材料與方法

1.1病例資料及分組

選擇2010年1月至2012年2月在本院住院的患有慢性肝纖維化的患者80例，隨機分為治療組和對照組。對照組40例，男性32例，女性8例，平均年齡（41.3±6.7）（35-46）歲；治療組40例，男性33例，女性7例，平均年齡（39.8±5.8）（36-43）歲。兩組病例在年齡分布、性別分布和治療前肝功能檢測比較差異均無統(tǒng)計學意義（P>0.05），具有可比性。

1.2治療方法

兩組患者均給予常規(guī)護肝治療及支持治療等治療。治療組在一般治療的基礎上口服冬蟲夏草口服液25ml，每天1次，療程12周，治療期間均不加用其它抗肝纖維化的藥物。

1.3觀察指標

1.3.1 血清學檢查

對照組和治療組所有患者抽取靜脈血3ml，經離心機離心后分離血清，送化驗室檢測。

1）檢測肝功能指標

利用全自動生化分析儀檢測丙氨酸轉氨酶（ALT）、谷草轉氨酶（AST）、白蛋白（ALb）和總膽紅素（TBiL）的變化。

2）檢測肝纖維化指標

利用放免分析法檢測透明質酸（HA）、層黏蛋白（LN）、Ⅲ型前膠原肽（PC-Ⅲ）和Ⅳ型膠原（CⅣ）的變化。

1.3.2 肝穿刺后Ⅰ型膠原（CollagenⅠ）和Ⅲ型膠原（CollagenⅢ）檢測

對照組和治療組各8名患者經局部麻醉，在CT的定位和引導下經皮穿刺，獲取肝臟標本約20毫克。將肝組織入4℃裂解液勻漿15 min，4℃離心，取上清，Bradford法測定肝組織蛋白濃度。肝組織蛋白經12%SDS-PAGE凝膠電泳分離，轉移至PVDF膜，脫脂奶粉室溫封閉2 h，1：300稀釋的CollagenⅠ抗體、CollagenⅢ抗體和MMP-13抗體4℃過夜，二抗（1：3000稀釋）與硝酸纖維素膜雜交。將膜置于ECL中1min，曝光，顯影，定影。采用IPP6.0圖像分析軟件對Western blot結果進行定量分析，結果以目的蛋白與β-actin的累積光密度值的比值表示。

1.4 統(tǒng)計學分析

所有數(shù)據(jù)以x? ± s 表示，采用SPSS13.0軟件進行t檢驗，P<0.05有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1肝功能指標

統(tǒng)計學分析顯示對照組與治療組治療后血清ALT、AST和TBiL水平與治療前相比均顯著降低，血清ALb水平與治療前相比顯著增加，表現(xiàn)為對照組治療后ALT、AST和TbiL比治療前分別降低69.3%（P<0.01）、67.9%（P<0.01）和62.3%（P<0.01），ALb比治療前增加31.0%（P<0.05）；治療組治療后ALT、AST和TbiL比治療前分別降低71.8%（P<0.01）、71.8%（P<0.01）和63.4%（P<0.01），ALb比治療前增加20.5%（P<0.05）；但兩組治療后ALT、AST、TBiL和Alb水平相比較無明顯差別（P>0.05）（Table1）。

2.2肝纖維化指標

統(tǒng)計學分析顯示對照組治療后血清HA、LN、PC-Ⅲ和CⅣ水平較治療前無統(tǒng)計學差異（P>0.05）；治療組治療后HA、LN、PC-Ⅲ和CⅣ水平與治療前相比均顯著降低表現(xiàn)為治療組治療后HA、LN、PC-Ⅲ和CⅣ水平比治療前分別降低39.9%（P<0.01）、43.1%（P<0.01）、38.5%（P<0.01）和25.4%（P<0.01）。治療組治療后HA、LN、PC-Ⅲ和CⅣ水平明顯低于對照組治療后，差別有統(tǒng)計學意義（Table2）。

2.3. 免疫印跡法測CollagenⅠ、CollagenⅢ和MMP-13變化

統(tǒng)計學分析顯示對照組與治療組治療后肝組織CollagenⅠ和CollagenⅢ水平與治療前相比均顯著降低，肝組織MMP-13水平與治療前相比顯著增加，表現(xiàn)為對照組治療后CollagenⅠ和CollagenⅢ水平比治療前分別降低22.5%（P<0.05）和17.0%（P<0.05），MMP-13比治療前增加21.9%（P<0.05）；治療組治療后CollagenⅠ和CollagenⅢ水平比治療前分別降低39.8%（P<0.01）和40.1%（P<0.01），MMP-13比治療前增加37.8%（P<0.05）。治療組治療后CollagenⅠ和CollagenⅢ水平明顯低于對照組治療后，MMP-13水平明顯高于對照組治療后，差別有統(tǒng)計學意義（Table3）。

3 討論

本實驗通過血清學檢測發(fā)現(xiàn)，對照組和治療組治療后ALT、AST和TBiL水平降低，ALb水平顯著增加，提示兩種治療方法均有效的改善了肝功能。肝纖維化指標顯示冬蟲夏草治療組治療后HA、LN、PC-Ⅲ和CⅣ水平與對照組治療后相比均顯著降低，而對照組治療后沒有顯著改變，暗示冬蟲夏草具有改善肝纖維化的功能，對肝細胞具有保護作用。免疫印跡結果顯示兩種治療方法均降低CollagenⅠ和CollagenⅢ，提高了MMP-13水平，而冬蟲夏草治療組治療后CollagenⅠ和CollagenⅢ水平低于對照組治療后，MMP-13水平高于對照組治療后，提示冬蟲夏草改善肝纖維化的機制可能通過降低CollagenⅠ和CollagenⅢ，提高MMP-13起到對肝細胞的保護作用。

研究顯示，肝星狀細胞（Hepatic stellate cell， HSC）的激活認為是肝纖維化過程中最重要的一步[3]。HSC激活并轉化為肌成纖維細胞樣細胞，通過增生和分泌細胞外基質參與肝纖維化的形成[4]，因此各種致纖維化因素均把肝星狀細胞作為最終靶細胞。冬蟲夏草有調節(jié)免疫系統(tǒng)功能、抗腫瘤、抗疲勞等多種功效。有研究報道，PDGF對HSC增殖有顯著促進作用，蟲草菌絲可顯著抑制纖維化肝臟PDGF的表達[5]。但其具體機制尚不清楚。本課題從另一個角度分析，冬蟲夏草可以通過降低CollagenⅠ和CollagenⅢ，提高MMP-13，起到抑制肝纖維化的作用。

細胞外基質包括膠原、糖蛋白及蛋白多糖等，其中膠原是最主要的成分，在肝臟中有Ⅰ型，Ⅲ型-Ⅵ型共5型，而以Ⅰ型和Ⅲ型為主。肝臟調控膠原代謝的關鍵酶是基質金屬蛋白酶（MMPs），其中MMP13是基質金屬蛋白酶家族中對肝臟膠原降解作用較強的酶[6]。本研究中通過免疫印跡觀察到的冬蟲夏草治療后CollagenⅠ和CollagenⅢ的降低，MMP-13的增高效果明顯高于一般治療，證實冬蟲夏草抑制了肝星狀細胞的激活，降低了CollagenⅠ和CollagenⅢ的合成，提高了MMP-13的表達，緩解了肝纖維化過程。

因此，本研究通過臨床實驗研究發(fā)現(xiàn)，冬蟲夏草口服液作為一種中藥制劑能夠抑制肝星狀細胞的激活，降低了CollagenⅠ和CollagenⅢ的合成，提高了MMP-13的表達，緩解肝纖維化過程，為冬蟲夏草臨床防治肝纖維化提供了新的理論依據(jù)。

參考文獻：

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