37℃下不同稀釋液對雞精子活率的影響

楊小霞 張娟

摘要：配制了pH、滲透壓接近的3種精液稀釋液，37 ℃下每隔2 h測定雞精子活率，直到全部精子死亡為止，計算精子存活時間和生存指數。結果表明，雞精子在B稀釋液中存活時間極顯著高于A稀釋液和C稀釋液（P<0.01），A、C稀釋液間差異不顯著（P>0.05）。雞精子在A、B、C 3種稀釋液中存活時間分別為（12.6±0.5） h、（14.0±0.3） h和（12.1±0.8） h，生存指數依次為5.7±0.6、6.6±1.7、2.9±0.8， 在A稀釋液和B稀釋液中生存指數極顯著高于C稀釋液（P<0.01），A稀釋液和B稀釋液差異不顯著（P>0.05）。

關鍵詞：雞精子；稀釋液；滲透壓；存活時間

中圖分類號：S831；S814.3 文獻標識碼：A 文章編號：1007-273X（2013）07-0012-03

目前在生產上常用的雞精液稀釋液有1%NaCl溶液，5%～7%葡萄糖溶液和葡萄糖卵黃溶液等，但實踐應用效果不理想。精液稀釋液各項指標是影響精子存活時間和生存指數的重要因素，尤其是稀釋液的pH值、滲透壓對精子生存指數的影響很大。盡管大量研究者對雞精液稀釋液的研究取得了很大進展，但如何根據雞精子在體外生理特點和變化規(guī)律，研制出配方簡單、價格低廉，易于推廣應用的常溫、低溫、冷凍的家禽精液稀釋液，還有待進一步的研究。陳元明等[1]研究認為雞精子在2～5 ℃條件下可存活10 d，而在30 ℃以上則只能存活數小時。本試驗制備了3種稀釋液，將采集的雞新鮮精液進行稀釋后，37 ℃下每隔2 h觀察一次精子活率，測定精子存活時間、生存指數等指標，以期了解提高溫度后稀釋液對雞精液保存效果的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗用雞 30只14月齡蛋用型羅曼種公雞為青海省畜牧獸醫(yī)職業(yè)技術學院養(yǎng)禽示范園飼養(yǎng)。

1.1.2 試劑 葡萄糖、果糖、氯化鎂、谷氨酸鈉、醋酸鈉、檸檬酸鉀、磷酸二氫鉀、磷酸氫二鈉、EDTA-Na2、N-三（羥甲基）甲基-2-氨基乙烷磺酸（TES）、超純水等。

1.1.3 儀器 精子質量評定系統(tǒng)、電子分析天平、滲透壓儀、貝克曼溫度計、數字pH計、普通溫度計、顯微鏡、數顯恒溫水浴鍋、集精杯等。

1.2 方法

1.2.1 稀釋液的制備 雞精液稀釋液配方見表1，按配方準確稱取所用試劑，溶解定容后用定性濾紙過濾，分裝在250 mL瓶中，100 ℃高溫高壓滅菌15 min，室溫冷卻后蠟封，陰涼處保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 精液的稀釋與保存 供試精液來自30只蛋用型羅曼種公雞，公雞經采精訓練，采用背腹聯合按摩法采集精液，并進行品質評定。將無糞尿污染精液混合，當活率大于0.6時供稀釋保存之用。將采集的混合鮮精液與各稀釋液按精液∶稀釋液（V/V）1∶4等溫稀釋，分裝于潔凈的青霉素空瓶中，加蓋后放入37 ℃恒溫水浴鍋中，保存觀察。

1.2.4 測定指標與方法 精子活率每隔2 h觀察一次，檢測時間與結果記入專用表格，直到全部精子死亡為止，最后計算精子存活時間和生存指數。過程中始終注意保存溫度的恒定與無菌操作，試驗重復4次。

1.2.5 滲透壓及pH的測定 采用冰點下降法測定各稀釋液的冰點下降度（Δt），按Δt/1.86×1 000換算為滲透摩爾濃度；使用PHS-2型酸度計測定各稀釋液的pH。

1.2.6 數據處理 4次試驗結果取平均值，計算每組數據的標準誤，并進行了方差分析。

2 結果與分析

3種稀釋液滲透壓和pH測定結果見表2。

3種稀釋液37℃下保存精液時精子存活時間與生存指數見表3，生存指數是指相鄰兩次精子活率均數與間隔時間乘積的總和。雞精子在B稀釋液中存活時間極顯著高于A稀釋液和C稀釋液（P<0.01），A、C稀釋液間差異不顯著（P>0.05）。雞精子在A、B、C 3種稀釋液中存活時間分別為（12.6±0.5）h、（14.0±0.3）h和（12.1±0.8）h，生存指數依次為5.7±0.6、6.6±1.7、2.9±0.8， 在A稀釋液和B稀釋液中生存指數極顯著高于C稀釋液（P<0.01），A稀釋液和B稀釋液差異不顯著（P>0.05）。

3 小結與討論

3.1 釋液液組成對精子保存的影響

稀釋液保存效果與稀釋液組成有著密切的關系。本試驗保存效果較好的A稀釋液和B稀釋液選擇果糖、谷氨酸鈉、氯化鎂、檸檬酸鉀等，在家禽稀釋液中添加果糖效果要優(yōu)于葡萄糖，并證實精子分解果糖速度較緩慢。張兆旺[2]研究結果顯示，果糖稀釋液中精子生存指數、存活時間和畸形率均優(yōu)于蔗糖，葡萄糖效果最差。蘇東頓等[3]也認為果糖是提高貯存精液受精能力的重要成分之一。

Harrison[4]研究認為谷氨酸鹽能延長雞體外精子壽命。張兆旺[5]認為谷氨酸鈉對精子有保護作用，并指出谷氨酸鈉在單獨配制稀釋液時以每100 mL含2.40～2.47 g為宜。張兆旺等[6]報道表明在葡萄糖-磷酸鹽類雞精液稀釋液中添加谷氨酸鈉優(yōu)于檸檬酸鈉。張堅中等[7]認為稀釋液中含有果糖、谷氨酸鈉、檸檬酸鈉和適量的K+、Mg2+能延長雞精子壽命，同時還指出在鹽成分上，檸檬酸鈉優(yōu)于氯化鉀。適量的K+是維持精子正常機能所必需的，Mg2+具有保護精子運動和延長其壽命的機能。本試驗中C稀釋液保存效果較差可能是因為配方中選擇了葡萄糖以及缺少適量的K+離子，從而影響了精子的存活時間。

3.2 稀釋液pH對精子保存的影響

研究顯示，保存效果最好的雞精液稀釋液pH為6.8～7.2，此時受精率顯著高于pH 5.8～6.2[8]。本試驗中A、B和C3種稀釋液的pH分別為7.0、6.9和7.3。由于精子代謝旺盛，能量消耗較快，導致代謝產物迅速積累，從而改變了pH，抑制了某些酶的活性，使精子喪失受精能力，故雞精液稀釋液pH要控制在一定范圍之內。陳理盾等[9]觀察了 9 種稀釋液 pH對精子存活時間、生存指數的影響，其優(yōu)等液 pH 6.7，精子存活時間 264 h，活率大于 0.6 的存活時間 148 h，pH范圍在 6.7～7.2 的4 種良等液的保存效果達到了北京家禽稀釋液（BJJX）的水平。李尚仁等[10]在雞精液冷凍保存試驗中，對精液稀釋液進行了篩選，結果效果最好的稀釋液pH為7.0，平均凍后活力達0.526。從以上試驗結果可以看出，無論雞精液是常溫還是低溫保存，欲使雞精液保存效果好，稀釋液的pH應與其生理范圍盡量接近。

3.3 稀釋液滲透壓對精子保存的影響

滲透壓是雞精液稀釋液的重要參數之一，在雞人工授精中，人們?yōu)閷ふ蚁♂屢鹤罴训臐B透壓進行了大量的研究。本試驗中A、B、C 3種稀釋液的滲透壓分別為318、327、307 mOs/kg，與雞的精子生存較為適宜的稀釋液滲透壓（278～434 mOs/kg）相近。但李尚仁等[10]認為適宜滲透壓是411～447 mOs/kg，陳元明等[1]指出在300～400 mOs/kg時為宜，同時30 ℃保存試驗證明雞精液隨著稀釋液滲透壓的升高或降低，精子生存指數下降，而與雞精液滲透壓相近或偏高的稀釋液中精子活力最好，存活時間最長。

雞精液稀釋液能夠為精子提供能量，保證適合雞精子生存的pH環(huán)境，維持適當的滲透壓和電解質平衡，中和緩解精子和微生物代謝產生的有害物質，沖淡精清中有害因子的濃度，延長精子在體外存活的時間，從而提高母雞受精率。所以在稀釋液配方物質的選擇上應該綜合考慮以上各種因素。

4 結論

（1）3種配方稀釋液在37℃下保存效果較好的為B液，其次為A液，而C液保存效果較差。

（2）配方中添加果糖、檸檬酸鉀能夠提高精子生存指數。

（3）如果溶劑質量得不到保證，可以在配方中加入少量EDTA-Na2，能夠保證稀釋液清亮和保存效果。

參考文獻：

[1] 陳元明，廖紀朝，黃美玉，等.雞精液稀釋保存技術的研究[J].中國農業(yè)科學，1987，20（6）：52-57.

[2] 張兆旺.稀釋液溶質和滲透壓對雞精子體外存活及形態(tài)的影響[J].中國家禽，2001，23（8）：50-52.

[3] 蘇東頓，丁余榮，王桂朝，等.提高肉用種雞人工授精效果的研究Ⅴ-肉用種雞精液稀釋液的篩選[J].中國家禽，1993（4）：13.

[4] HARRISON R J.Reproduction and reproductive organs in common seals （Phoca vitulina）， in the Wash，East Anglia[J]. Mammalia ，1960（24）：372-385.

[5] 張兆旺.37℃下稀釋液滲透壓對雞精子存活的影響[J].甘肅畜牧獸醫(yī)，2001，31（3）：1-3.

[6] 張兆旺，姚希芳.影響雞精液3℃下保存效果的因素[J].中國家禽，2002，24（13）：23.

[7] 張堅中，徐鐵錚.家畜冷凍精液[M].北京：中國農業(yè)科技出版社，1988.

[8] 權 凱，肖曙光，黃炎坤.雞精液稀釋液研究進展[J].河南畜牧獸醫(yī)，2005，2（3）：6-8.

[9] 陳理盾，權 凱，黃炎坤.雞精液稀釋液的選擇及其影響因素分析[J].中國家禽，2011，33（1）：45-46.

[10] 李尚仁， GRAHAM E F.不同處理對5℃保存的雞精液的影響[J].中國農業(yè)科學，1986（3）：83-89.