一種腸類器官樣本快速石蠟塊的制作方法

李 麗，陳 菲，包春娟，周琪琪，陳紅英

類器官于2009年由Sato等[1]首次報(bào)道，其能較好地模擬體內(nèi)細(xì)胞三維生長(zhǎng)的生理?xiàng)l件，目前已廣泛應(yīng)用于疾病的研究并成為最具前景的實(shí)驗(yàn)技術(shù)。腸道病理的藥理學(xué)、毒理學(xué)或微生物研究中常采用人或小鼠腸道組織進(jìn)行腸類器官培養(yǎng)[2]。腸類器官培養(yǎng)成為研究和治療腸道疾病可行的方法[3]，也是一種全新的消化道疾病體外研究模型。腸類器官在Matrigel三維基質(zhì)膠內(nèi)培養(yǎng)，通常被培養(yǎng)在24孔培養(yǎng)板內(nèi)，由Matrigel基質(zhì)膠包裹，基質(zhì)膠直徑5 mm，厚0.5～1 mm，培養(yǎng)2周左右彌散于基質(zhì)膠內(nèi)的腸類器官肉眼呈針尖大小。培養(yǎng)結(jié)束需借助病理技術(shù)手段，檢測(cè)培養(yǎng)的腸類器官組織細(xì)胞的形態(tài)結(jié)構(gòu)及與相關(guān)蛋白的表達(dá)情況，但目前對(duì)類器官的包埋技術(shù)仍有較高難度。本實(shí)驗(yàn)室采用快速脫水流程制作出適用于常規(guī)HE及免疫熒光雙重染色的優(yōu)質(zhì)腸類器官石蠟切片，現(xiàn)介紹如下。

1 材料與方法

1.1 材料人結(jié)腸組織采用人腸類器官培養(yǎng)基IntestiCult Organoid Growth Medium(Stem Cell Technology公司，#06010)在基質(zhì)膠Matrigel(Corning，#356237)內(nèi)培養(yǎng)2周左右形成的腸類器官樣本30例，10%中性緩沖福爾馬林，無(wú)水乙醇，二甲苯，蘇木精染液(貝索公司，BA4041)，伊紅染液(Thermo公司，7111)，EDTA抗原修復(fù)液(福州邁新公司，MVS-0099)，mouse anti-E-Cadherin抗體(1 ∶100，CST)，rabbit anti-Ki-67抗體(1 ∶200，CST)，Alexa Fluor 488 goat anti-mouse熒光抗體(1 ∶500，Invitrogen公司)，Alexa Fluor 647 donkey anti-rabbit熒光抗體(1 ∶500，Invitrogen公司)，Wash Buffer(Dako公司，DM831)，DAPI(Sigma公司，D9542-5MG)，增強(qiáng)型抗淬滅封片劑(佰諾全景0022001010)，Super PAP Pen超級(jí)免疫組化油筆(福州邁新公司，PEN-0002)，全自動(dòng)脫水機(jī)(Thermo Excelsior AS)，全自動(dòng)封片儀(Thermo ClearVue)，WSI全數(shù)字切片掃描儀(3DHISTECH Pannoramic SCAN)，正置熒光顯微鏡(Leica DM4000B)。

1.2 方法

1.2.1進(jìn)脫水機(jī)前處理 將培養(yǎng)在24孔板內(nèi)的腸類器官樣本用10%中性緩沖福爾馬林固定2 h；雙蒸水漂洗3次，每次1 min；將75%乙醇、85%乙醇、95%乙醇分別加入24孔板內(nèi)脫水10 min；脫水后將有一定硬度的包裹腸類器官樣本的基質(zhì)膠用眼科鑷輕輕取出，放入大小5 cm×5 cm的單層卷紙內(nèi)且基質(zhì)膠底面朝下放置，并在基質(zhì)膠周圍用鉛筆畫(huà)圈定位，折疊好后放入已打印好編號(hào)的包埋盒內(nèi)。

1.2.2快速脫水 將包埋盒放入全自動(dòng)脫水機(jī)進(jìn)行脫水、透明、浸蠟流程，快速脫水程序設(shè)置如下：55%乙醇、65%乙醇、75%乙醇、85%乙醇、95%乙醇(Ⅰ、Ⅱ)、無(wú)水乙醇(Ⅰ、Ⅱ)分別5 min；二甲苯Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ分別5 min，63 ℃石蠟Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ各10 min，整個(gè)過(guò)程耗時(shí)不超過(guò)2 h。

1.2.3包埋與石蠟切片 打開(kāi)卷紙，在鉛筆劃圈處找到腸類器官樣本，用電熱鑷將樣本迅速放入注滿蠟液的熱包埋模具[4]中央底部，轉(zhuǎn)入包埋機(jī)小冷臺(tái)輕壓平，待底部凝固迅速放上包埋盒底盒再移至大冷凍臺(tái)速冷。常規(guī)石蠟切片，腸類器官樣本連續(xù)切片直至切完整個(gè)基質(zhì)膠，避免再次切片時(shí)損失樣本，切片厚度4 μm。

1.2.4常規(guī)HE及免疫熒光雙重染色 (1)常規(guī)HE染色流程：石蠟切片常規(guī)脫蠟水化后入蘇木精染液2 min，0.5%鹽酸乙醇分化數(shù)秒，溫水返藍(lán)后入伊紅染液20 s，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，全自動(dòng)封片儀封片，WSI全數(shù)字切片掃描儀掃片。(2)免疫熒光雙重染色流程：石蠟切片常規(guī)脫蠟水化后，EDTA(pH 9.0)抗原修復(fù)液97 ℃修復(fù)30 min，山羊與驢混合血清[5]室溫封閉30 min，滴加一抗混合液(E-Cadherin與Ki-67工作液1 ∶1混合)4 ℃孵育過(guò)夜，次日室溫復(fù)溫后Wash Buffer漂洗3次，避光滴加熒光二抗混合液(Alexa Fluor 488與Alexa Fluor 647熒光二抗工作液1 ∶1混合)37 ℃避光孵育30 min，甩掉二抗直接滴加DAPI工作液，2×SSC漂洗，雙蒸水洗后用抗淬滅劑封片，正置熒光顯微鏡下觀察。

2 結(jié)果

眼觀可見(jiàn)培養(yǎng)在24孔培養(yǎng)板內(nèi)呈類圓形，厚0.5～1 mm，直徑5 mm的Matrigel基質(zhì)膠，基質(zhì)膠內(nèi)彌散培養(yǎng)的腸類器官樣本呈針尖大小。腸類器官樣本石蠟切片HE染色可見(jiàn)典型的空腔樣腸類器官結(jié)構(gòu)及萌芽結(jié)構(gòu)，上皮細(xì)胞核呈藍(lán)色，細(xì)胞質(zhì)呈粉紅色(圖1)。腸類器官樣本石蠟切片行E-Cadherin與Ki-67免疫熒光雙重染色，可見(jiàn)典型的空腔樣腸類器官結(jié)構(gòu)及萌芽結(jié)構(gòu)上皮均高表達(dá)E-Cadherin蛋白，即幾乎所有腸類器官上皮細(xì)胞膜顯示綠色熒光，部分增殖上皮表達(dá)Ki-67蛋白，即部分腸類器官上皮細(xì)胞核顯示紅色熒光且與細(xì)胞核染料DAPI重疊，無(wú)明顯背景熒光(圖2)。

圖1 腸類器官樣本在基質(zhì)膠內(nèi)培養(yǎng)后大體及HE染色圖：A.箭頭所指兩個(gè)類圓形區(qū)域?yàn)槟c類器官用Matrigel三維基質(zhì)膠培養(yǎng)固定后，滴染1滴伊紅染液，基質(zhì)膠內(nèi)生長(zhǎng)的腸類器官樣本肉眼呈針尖大??；B.HE染色可見(jiàn)典型的空腔樣腸類器官結(jié)構(gòu)及萌芽結(jié)構(gòu)，上皮細(xì)胞核呈藍(lán)色，細(xì)胞質(zhì)呈粉紅色 圖2 E-Cadherin與Ki-67免疫熒光雙重染色：A.細(xì)胞核染料DAPI呈藍(lán)色；B.腸類器官上皮高表達(dá)E-Cadherin蛋白，即幾乎所有腸類器官上皮細(xì)胞膜顯示綠色熒光；C.部分增殖上皮表達(dá)Ki-67蛋白，即部分腸類器官上皮細(xì)胞核顯示紅色熒光；D.E-Cadherin與Ki-67免疫熒光雙重染色與細(xì)胞核染料DAPI重疊

3 討論

類器官培養(yǎng)是一種三維空間培養(yǎng)，是過(guò)去10年干細(xì)胞培養(yǎng)較大的進(jìn)展之一。除了腸類器官培養(yǎng)，近幾年文獻(xiàn)還報(bào)道肝類器官[6]、腦類器官[7]、腎類器官[8]等類器官培養(yǎng)技術(shù)，為體外研究相關(guān)組織器官疾病提供了全新的體外研究模型。培養(yǎng)的類器官樣本通過(guò)常規(guī)HE染色觀察類器官的組織細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)，利用免疫熒光染色技術(shù)分析類器官內(nèi)蛋白定位及表達(dá)情況。腸類器官三維培養(yǎng)樣本小且彌散于Matrigel基質(zhì)膠內(nèi)，基質(zhì)膠固定前后用鑷子夾取均易夾碎，從24孔板取出環(huán)節(jié)操作十分困難。作者經(jīng)反復(fù)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，基質(zhì)膠固定后行短時(shí)間梯度乙醇脫水容易變硬，易從24孔板取出。由于大體觀腸類器官樣本只有針尖大小，石蠟包埋切片環(huán)節(jié)容易將腸類器官樣本切掉，作者發(fā)現(xiàn)切片成功需注意以下幾點(diǎn)：(1)進(jìn)脫水機(jī)前處理環(huán)節(jié)，送檢的腸類器官樣本進(jìn)脫水機(jī)前除使用10%中性緩沖福爾馬林固定外[9]，還需利用梯度乙醇脫水硬化的作用將24孔培養(yǎng)板內(nèi)包裹腸類器官的基質(zhì)膠處理變硬，利于眼科鑷夾出變硬后的腸類器官樣本。再用鉛筆在卷紙上圈出樣本放置的位置，經(jīng)實(shí)踐證實(shí)這樣操作后期打開(kāi)包埋紙時(shí)可快速找到樣本。(2)脫水包埋環(huán)節(jié)：使用本實(shí)驗(yàn)室已有的快速細(xì)胞蠟塊脫水流程[55%乙醇、65%乙醇、75%乙醇、85%乙醇、95%乙醇(Ⅰ、Ⅱ)、無(wú)水乙醇(Ⅰ、Ⅱ)分別5 min；二甲苯Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ分別5 min，63 ℃石蠟Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ各10 min，整個(gè)過(guò)程耗時(shí)不超過(guò)2 h)]處理的腸類器官樣本質(zhì)量好不發(fā)脆，石蠟切片無(wú)厚薄不均、裂痕、顫痕、褶皺現(xiàn)象，易于切出優(yōu)質(zhì)的連續(xù)切片。包埋環(huán)節(jié)參照羅添友等[4]報(bào)道的用熱包埋模具包埋脫水后薄如紙的腸類器官樣本，在此文獻(xiàn)基礎(chǔ)上改良包埋操作中的一個(gè)小細(xì)節(jié)，即一次性將熱包埋模具填充滿蠟液，避免二次充蠟改變腸類器官樣本底面平整的位置，樣本包埋平整可減少后續(xù)石蠟切片粗修次數(shù)，采用細(xì)修修出完整樣本面，再一次性連續(xù)切片切完整個(gè)基質(zhì)膠包裹的腸類器官樣本，本實(shí)驗(yàn)每張防脫玻片撈3張石蠟切片，一個(gè)腸類器官石蠟塊連續(xù)切片后可以撈片15張左右。(3)免疫熒光雙重染色環(huán)節(jié)：本實(shí)驗(yàn)中兩個(gè)抗體來(lái)源于不同宿主，通過(guò)間接法免疫熒光雙重染色技術(shù)[5]可以將兩種不同來(lái)源的一抗同時(shí)孵育，節(jié)約染色操作時(shí)間。為避免熒光串色，本實(shí)驗(yàn)選擇Alexa Fluor 488熒光通道與Alexa Fluor 647熒光通道的激發(fā)波長(zhǎng)與發(fā)射波長(zhǎng)均無(wú)交叉。本實(shí)驗(yàn)還用抗淬滅封片劑有效避免熒光淬滅問(wèn)題。

目前，本科室已順利完成50余例腸類器官樣本HE染色及免疫熒光雙重染色實(shí)驗(yàn)，染色效果均良好，該腸類器官樣本快速石蠟塊的制作方法值得推廣，也值得應(yīng)用到肝、腎、腦及心臟等類器官培養(yǎng)樣本的石蠟切片制作中。