感冒疏風(fēng)顆粒的微生物限度檢查方法學(xué)驗證

方慧祥　解翠珠

摘要：目的：建立感冒疏風(fēng)顆粒微生物限度檢查方法。方法：按《中國藥典》2010版的要求[1]，通過接種代表性的陽性菌株，用常規(guī)法、稀釋法及薄膜過濾法對五株陽性菌株進行回收率測定。結(jié)果：該樣品沒有抑菌性，常規(guī)法、稀釋法及薄膜過濾法對五株陽性菌株回收率均高于70%。結(jié)論：本樣品細(xì)菌數(shù)、霉菌數(shù)和酵母菌數(shù)及控制菌大腸埃希菌均可采用常規(guī)法進行檢查。

關(guān)鍵詞：感冒疏風(fēng)顆粒；微生物限度檢查；回收率；方法學(xué)驗證

中圖分類號：R284.2文獻標(biāo)志碼：A

文章編號：1007-2349（2013）08-0059-02

感冒疏風(fēng)顆粒具有辛溫解表，宣肺和中的功能[2]。臨床用于治療風(fēng)寒感冒，發(fā)熱咳嗽，頭痛怕冷，鼻流清涕，骨節(jié)酸痛，四肢疲倦。當(dāng)建立產(chǎn)品的微生物限度檢查法時，應(yīng)進行細(xì)菌、霉菌及酵母菌數(shù)計數(shù)方法的驗證，以確認(rèn)所采用的方法適合于該產(chǎn)品的細(xì)菌、霉菌及酵母菌數(shù)的測定[1]。本文通過接種代表性的五株陽性菌株，采用常規(guī)法、稀釋法及薄膜過濾法進行微生物限度檢查方法學(xué)驗證實驗，為該樣品建立了微生物限度檢查方法。

1儀器與材料

1.1儀器HTY-2000A集菌儀（杭州高得醫(yī)療器械有限公司）；開放式集菌器（北京牛?；蚣夹g(shù)有限公司，批號：20101005）。

1.2樣品感冒疏風(fēng)顆粒（云南雄業(yè)制藥有限公司，規(guī)格/袋，批號20110101，20110102，20110103，20101001，20101105）。

1.3培養(yǎng)基和試劑改良馬丁液體培養(yǎng)基（批號，1011042），改良馬丁瓊脂培養(yǎng)基（批號，010315），玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基（批號，110208），營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基（批號，110120），營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基（批號，101224），膽鹽乳糖增培養(yǎng)基（批號，101226），北京三藥科技開發(fā)公司。

1.4菌種大腸埃希菌（Escherichia coli）[CMCC（F）44102]、枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）[CMCC（B）63 501]、金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）[CMCC（B）26 003]、白色念珠菌（Candida albicans）[CMCC（F）98 001]、黑曲霉（Aspergillus niger）[CMCC（F）98 003]（中國藥品生物制品檢定所提供）

2方法

按中國藥典2010版一部微生物限度檢查法（附錄XⅢ C）[1]進行實驗。

2.1菌液制備取經(jīng)34℃培養(yǎng)18～24 h，大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌肉湯液體培養(yǎng)物1 mL，加入9 mL 0.9%氯化鈉溶液中，10倍稀釋至10-5～10-7備用；取經(jīng)24℃培養(yǎng)18～24 h的白色念珠菌液體培養(yǎng)物1 mL，加入9 mL 0.9%氯化鈉溶液中，10倍稀釋至10-6備用；取經(jīng)培養(yǎng)一周的黑曲霉菌斜面物，加0.9%氯化鈉溶液3mL，洗下孢子，轉(zhuǎn)移至另一空管，標(biāo)準(zhǔn)比濁后，取1 mL加入0.9%氯化鈉溶液中10倍稀釋至10-4備用。

2.2菌液的檢驗取上述金黃色葡萄球菌、枯草桿菌、大腸埃希菌10-5～10-7稀釋液各1 mL，用45℃營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基20 mL注皿，各平行測定兩皿，30～35℃培養(yǎng)48 h，計數(shù)，應(yīng)約為50～100 cfu/mL；取上述白色念珠菌10-5～10-6稀釋液及上述黑曲霉菌10-4孢子懸液各1 mL，用45℃玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基20 mL注皿，各平行測定兩皿，23～28℃培養(yǎng)，逐日觀察計數(shù)，應(yīng)約為50～100 cfu/mL。結(jié)果見表1。

2.3供試液制備取樣品10 mg，加pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液100 ml，用勻漿議混勻，作為1：10的供試液。

2.4回收率的測定

2.4.1細(xì)菌數(shù)霉菌數(shù)常規(guī)法測定試驗組：取1：10供試液1 mL、50～100 cfu 試驗菌同時加入平皿中，立即傾注瓊脂培養(yǎng)基，待凝固后，置規(guī)定溫度培養(yǎng)24～72 h逐日觀察結(jié)果。

菌液組：測定每一菌株所加的試驗菌數(shù)（同菌液檢驗）。

供試品對照組：取1：10供試液1 mL加入平皿中，立即傾注瓊脂培養(yǎng)基，待凝固后，置規(guī)定溫度培養(yǎng)24～72 h逐日觀察結(jié)果，測定供試品本底菌數(shù)

2.4.2細(xì)菌數(shù)霉菌數(shù)稀釋法測定試驗組：取1：10供試液0.2 mL/皿、50～100 cfu試驗菌同時加入平皿中，立即傾注瓊脂培養(yǎng)基，待凝固后，置規(guī)定溫度培養(yǎng)24～72 h逐日觀察結(jié)果。

菌液組：測定每一菌株所加的試驗菌數(shù)（同菌液檢驗）。

2.4.3細(xì)菌數(shù)霉菌數(shù)薄膜過濾法測定取1：10的供試液1 mL，注入開放式濾器（先用少量緩沖液潤濕濾器），用pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液沖洗濾膜，每次100 mL共4次（每次充分振搖濾器，總沖洗400 mL），留有少量緩沖液加1 mL（50～100 cfu）試驗菌混勻，抽干后，取出濾膜菌面朝上貼入規(guī)定瓊脂平板培養(yǎng)基中，置規(guī)定溫度培養(yǎng)48 h，結(jié)果見表2。

2.5回收率的計算按如下公式計算試驗組的加菌回收率：

試驗組的加菌回收率=

試驗組的平均菌落數(shù)-供試品對照組的平均菌落數(shù)菌液組的平均菌落數(shù)×100%

2.6控制菌檢查方法的驗證

2.6.1常規(guī)法取1：10供試液10 mL加入100 mL膽鹽乳糖培養(yǎng)基中，同時加入上述大腸埃希菌液1 mL，置35℃培養(yǎng)24 h；取pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液10 mL加入100 mL膽鹽乳糖培養(yǎng)基，同時加入金黃色葡萄球菌液1 mL，置35℃培養(yǎng)24 h，作為陰性菌對照組。另取1：10供試液1 mL加入10 mL膽鹽乳糖發(fā)酵培養(yǎng)基中，同時加入上述大腸埃希菌液1 mL，置35℃培養(yǎng)24 h；取1：10供試液1 mL加入10 mL膽鹽乳糖發(fā)酵培養(yǎng)基中置35℃培養(yǎng)24 h，作為陰性對照。

3結(jié)果與討論

3.1結(jié)果見表1、表2。

4結(jié)論

本樣品通過接種5株陽性試驗菌株進行方法學(xué)驗證，通過進行3次平行實驗，驗證了其方法的有效性和可靠性，建立了感冒疏風(fēng)顆粒微生物限度檢查的方法：細(xì)菌數(shù)、霉菌數(shù)和酵母菌數(shù)、控制菌大腸埃希菌均可采用常規(guī)法法進行檢查。

參考文獻：

[1]國家藥典委員會.中國藥典2010年版[S].一部.北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2010.

[2]國家中成藥匯編.中成藥地方標(biāo)準(zhǔn)上升國家標(biāo)準(zhǔn)部分[S].北京：人民衛(wèi)生出版社，2001.

（收稿日期：2013-06-17）