酸降解法制備褐藻寡糖抗氧化性的研究

胡博旸,聶　瑩,孫　路,韭澤悟,殷麗君,周　輝,李茉莉,程永強,*

(1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué),生物科學(xué)技術(shù)學(xué)院,湖南長沙 410128; 2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所,農(nóng)業(yè)部農(nóng)產(chǎn)品加工綜合性重點實驗室,北京 100193; 3.中國農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與營養(yǎng)工程學(xué)院,植物源功能食品北京市重點實驗室,北京 100083; 4.日本國際農(nóng)林水產(chǎn)業(yè)研究中心,日本筑波 305-8686; 5.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué),食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院,湖南長沙 410128)

?

酸降解法制備褐藻寡糖抗氧化性的研究

胡博旸1,聶瑩2,孫路3,韭澤悟4,殷麗君3,周輝5,李茉莉1,程永強3,*

(1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué),生物科學(xué)技術(shù)學(xué)院,湖南長沙 410128; 2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所,農(nóng)業(yè)部農(nóng)產(chǎn)品加工綜合性重點實驗室,北京 100193; 3.中國農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與營養(yǎng)工程學(xué)院,植物源功能食品北京市重點實驗室,北京 100083; 4.日本國際農(nóng)林水產(chǎn)業(yè)研究中心,日本筑波 305-8686; 5.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué),食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院,湖南長沙 410128)

從褐藻膠中提取出聚甘露糖醛酸和聚古羅糖醛酸,利用鹽酸降解聚甘露糖醛酸和聚古羅糖醛酸1、2、6 h分別制備了甘露糖醛酸組分(M1、M2和M3)以及古羅糖醛酸組分(G1、G2和G3),并且以肌肽和甘露糖為對照評估寡糖對DPPH自由基、超氧自由基和羥自由基的清除作用。結(jié)果表明,甘露糖醛酸以及古羅糖醛酸對DPPH自由基、超氧自由基具有良好的清除作用,且清除作用隨著寡糖中還原糖含量的增加而增加。在DPPH體系中,M3的清除效果要好于肌肽,G3的清除效果與肌肽相近。在超氧自由基體系中,M3的清除作用高于M2和M1,而G3的清除作用略低于肌肽。在羥自由基體系中,甘露糖醛酸和古羅糖醛酸的清除效果低于肌肽和甘露醇。實驗表明,酸法制備的褐藻寡糖具有較強的抗氧化能力,且抗氧化效果與寡糖的平均聚合度含量有關(guān)。

抗氧化,酸解,褐藻酸鈉,褐藻寡糖

生物體在進(jìn)行生命活動過程中會產(chǎn)生氧自由基,在人體內(nèi)氧自由基的含量被一些酶如超氧化物歧化酶以及抗氧化物所控制。然而,過量的氧自由基會對細(xì)胞造成損傷,同時會使蛋白質(zhì)損傷、酶失活、DNA損傷以及脂質(zhì)過氧化等[1]。而氧自由基的累積和動脈粥樣硬化、血栓的形成、糖尿病、肝炎和癌癥等疾病有很大的關(guān)聯(lián)[2-3]?？寡趸瘎┚哂星宄w內(nèi)多種氧自由基的作用,因此探究活性物質(zhì)的抗氧化性以及效率,對于預(yù)防多種疾病具有重要意義。

褐藻膠是由β-D-甘露糖醛酸(M)和α-L-古洛糖醛酸(G)通過1,4-糖苷鍵連接的線性水溶性酸性多糖[4]。而褐藻寡糖是褐藻膠的寡聚物,研究表明褐藻寡糖是一種具有多重功能性的活性寡糖,例如促進(jìn)植物生長[5]、保護神經(jīng)元[6]、增強免疫功能[7]、抗腫瘤[8]等,但是對于褐藻寡糖在體外抗氧化方面的研究僅是在近幾年才逐漸有所報道。如Sen[9]從寡糖分子量大小,G/M比值不同兩個角度探討了褐藻寡糖對DPPH自由基的清除效果;孫麗萍[10]對三種不同分子量的褐藻寡糖混合物在清除超氧陰離子,羥自由基和次氯酸三種自由基方面進(jìn)行了研究。上述研究基于酶法制備褐藻寡糖,酶解制備寡糖主要是通過催化1,4-糖苷鍵發(fā)生β-消除,在C-4和C-5位形成雙鍵,從而形成不飽和的寡聚糖醛酸寡糖,酸降解法則是通過非選擇性的斷裂分子間的糖苷鍵,所得寡糖保留了褐藻膠的大分子結(jié)構(gòu),形成飽和的寡糖產(chǎn)物。本文主要是通過酸法制備褐藻寡糖,通過pH分級對兩種糖醛酸進(jìn)行完全的分離,探討兩種寡聚糖醛酸混合物對自由基的清除能力,發(fā)現(xiàn)了其在抗氧化性方面的獨特功效,對于未來的生物制藥及保健品開發(fā)提供科學(xué)支撐。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)、三羥甲基氨基甲烷(Tris)、D-葡萄糖醛酸、肌肽Sigma公司;褐藻膠西隴化工股份有限公司;甘露醇鄭州博研生物科技有限公司;其他試劑為市售分析純,均購自國藥集團化學(xué)試劑北京有限公司。

T6紫外分光光度計北京普析通用儀器有限公司;Model 550酶標(biāo)儀美國BIO-RAD公司;XMT數(shù)顯調(diào)節(jié)水浴鍋余姚長江溫度儀表廠;S21-1恒溫磁力攪拌器上海司樂儀器有限公司;PB-10 PH計德國哥根廷Sartorius公司。

1.2實驗方法

1.2.1酸降解法制備褐藻寡糖按照Haug[11]的方法略有改變,將褐藻膠用蒸餾水配制成3%(w/v)的膠體溶液,電動攪拌機攪拌10 h使其充分溶脹。在膠體溶液中緩慢加入一定量的濃鹽酸,使溶液中的鹽酸濃度為0.5 mol/L。

溶液在90 ℃下反應(yīng)10 h,然后離心(轉(zhuǎn)速8000 r/min,5 min)取沉淀。沉淀用8%(w/w)的NaHCO3溶液溶解,在溶解液中緩慢加入0.3 mol/L的鹽酸調(diào)節(jié)pH至2.85±0.01,靜置分層,得黃色上清液及沉淀。上清液部分加入3倍體積95%乙醇,待白色沉淀析出,抽濾取沉淀,沉淀即為粗聚甘露糖醛酸(PM)。將沉淀與上清液分離,在沉淀中加入0.5 mol/L的鹽酸后重復(fù)上述操作2～3次獲得純度較高的PM。

沉淀部分(PM)加水至6%(w/v),用10%(w/v)的NaOH的調(diào)解pH至7.0～8.0,過濾溶液除去部分雜質(zhì)。濾液調(diào)pH至2.85±0.01,回收沉淀。沉淀即為粗聚古羅糖醛酸(PG),重復(fù)上述操作2～3次獲得純度較高的PG。

1.2.2酸降解PM片段和酸降解PG片段的制備按照張洪榮[12]的方法,將PM和PG分別配制成1%(w/v)的水溶液,并分別將溶液pH調(diào)至4.0和3.8。然后將溶液置于120 ℃的油浴鍋中,分別反應(yīng)1、2、6 h,以制備三組還原糖含量有顯著差異性的褐藻寡糖組分,6 h后其反應(yīng)所得還原糖含量與6 h時幾乎無明顯差異。將反應(yīng)后的水解液冷卻至室溫,用0.5 mol/L NaOH溶液將其pH范圍調(diào)至7.0～8.0。并將反應(yīng)液中放入1%(m/v)的活性炭,在60 ℃水浴鍋中攪拌30 min后過濾,將濾液冷凍干燥得樣品粉末,分別稱為M1、M2、M3;G1、G2、G3。

1.2.3還原糖含量測定采用DNS法[13]分別測定PM、M1、M2、M3、PG、G1、G2、G3的還原糖含量并與同濃度的肌肽對比(以下實驗均為3次平行實驗)

1.2.4褐藻寡糖對DPPH自由基的清除作用分別吸取10、20、30、40 mg/mL的M1的樣品100 μL于酶標(biāo)板樣品孔中,再用連續(xù)加液器快速在各樣品孔中加入50 μL 200 μmol/L的DPPH溶液,避光反應(yīng)20 min后,用酶標(biāo)儀在波長517 nm下測定吸光值A(chǔ)1,以100 μL的蒸餾水代替樣品的空白組吸光值A(chǔ)0,根據(jù)以下公式計算清除率。同樣方法測定M2、M3、G1、G2、G3的清除率。以肌肽作為對照。

式(1)

1.2.6褐藻寡糖對羥自由基(·OH)的清除作用采用Fenton反應(yīng)體系,按照表1將溶液添加進(jìn)試管,混勻在37 ℃水浴鍋中水浴30 min,在波長520 nm下測定吸光值,根據(jù)式(2)求出清除率。以肌肽和甘露醇作為對照。

表1　羥自由基清除率測定方法

式(2)

其中:A1-樣品管的吸光值;A2-樣品參照管的吸光值;A3-損傷管的吸光值;A4-未損傷管的吸光值;A0-空白管的吸光值。

1.3數(shù)據(jù)處理

實驗結(jié)果均為3次重復(fù)操作的均值,統(tǒng)計分析均應(yīng)用SPSS(version20,IBMSoftware,Inc.)處理。顯著性差異分析采用Duncan多重比較,當(dāng)p<0.05時,認(rèn)為差異顯著。應(yīng)用Origin8.5(OriginLab,Inc.)繪圖。

2　結(jié)果與討論

2.1測定不同降解時間的褐藻酸降解物中還原糖的含量

將酸解得到的甘露糖醛酸和古羅糖醛酸配制成1.0mg/mL的溶液,測定還原糖的含量,結(jié)果如圖1和圖2所示。結(jié)果表明,酸解0、1、2、6h后得到的PM、M1、M2、M3及PG、G1、G2、G3的還原糖含量有顯著差異,而酸解6h以上的甘露糖醛酸和古羅糖醛酸的還原糖含量與酸解6h得到的甘露糖醛酸和古羅糖醛酸的還原糖含量差異不明顯(因其非本研究重點,結(jié)果未顯示)。

圖1　不同酸降解時間的聚甘露糖醛酸樣品中的還原糖含量Fig.1　The concentration of reducing sugar from the hydrolysis of Polymannuronates by different reaction time periods

圖2　不同酸降解時間的聚古羅糖醛酸樣品中的還原糖含量Fig.2　The concentration of reducing sugar from the hydrolysis of Polyguluronates by different reaction time periods

由圖1和圖2可以看出,酸解1、2、6 h后的反應(yīng)液中還原糖含量依次顯著增加(p<0.05)。多糖一般是由許多單體相互連接而成,無法形成具有還原性的糖分子或者還原性很弱。所以還原糖含量的增加,說明溶液中總糖的平均聚合度在逐漸地降低。本次研究選取還原糖含量具有明顯差異的樣品G1、G2、G3,對褐藻膠酸降解物進(jìn)行還原糖含量與抗氧化性之間關(guān)系的研究,間接探究寡糖分子平均聚合度與其抗氧化能力的關(guān)系。

2.2褐藻膠酸降解物還原糖的含量與清除DPPH自由基能力之間的關(guān)系

測定甘露糖醛酸組分(M1、M2和M3)以及聚古羅糖醛酸組分(G1、G2和G3)對DPPH自由基清除能力并與同濃度的肌肽對比,結(jié)果如圖3和圖4所示。

圖3　不同還原糖含量的聚甘露糖醛酸樣品對DPPH自由基的清除作用Fig.3　Inhibitory rate on DPPH radicals by M1,M2,M3,carnosine

圖4　不同還原糖含量的聚古洛糖醛酸樣品對DPPH自由基的清除作用Fig.4　Inhibitory rate on DPPH radicals by G1,G2,G3,carnosine

從圖3和圖4中可以看出隨著各個樣品濃度的增加,聚古羅糖醛酸和聚甘露糖醛酸清除DPPH的能力逐漸加強。此外,隨著還原糖量的增加,兩種糖醛酸對于DPPH的清除能力不斷提高。本實驗選擇肌肽作為參對照,肌肽是一種由β-丙氨酸和組氨酸組成的二肽,是一種天然的、食品工業(yè)中常用的抗氧化劑[14]。從圖3中可以看出降解6 h的聚甘露糖醛酸M3對DPPH·的清除率要高于肌肽,而降解6 h的聚古羅糖醛酸G3對DPPH·的清除率低于肌肽,但相差不大。結(jié)合還原糖測定結(jié)果(圖1、圖2),發(fā)現(xiàn)還原糖含量高的褐藻寡糖的DPPH自由基清除作用較強。Sen[15]測定了輻照降解的褐藻寡糖對DPPH自由基的清除作用,研究表明,分子量越低的寡糖具有較高的清除作用,與本文研究結(jié)果一致。

圖5　不同還原糖含量的聚甘露糖醛酸樣品對超氧自由基的清除作用Fig.5　Inhibitory rate on superoxide radicals by M1,M2,M3,mannite,carnosine

圖6　不同還原糖含量的聚古洛糖醛酸樣品對超氧自由基的清除作用Fig.6　Inhibitory rate on superoxide radicals by G1,G2,G3,mannite,carnosine

從圖5中可以看出,在M1、M2和M3三種還原糖量逐漸增加的聚甘露糖醛酸樣品中,M3對超氧自由基的清除作用高于M1和M2。但是M1和M2對超氧自由基的抑制作用差距不大,反而還原糖量稍低的M1的抑制作用稍高于M2,這可能是由于超氧自由基的抑制對于還原糖的含量要求較高,還原糖濃度較低時抑制作用不明顯。從圖6中可以看出,三種古羅糖醛酸隨著濃度的增加,對超氧自由基的抑制能力均逐漸提高。同時隨著還原糖量的增加,對超氧自由基的抑制能力也逐漸增加。但是G3在20 mg/mL的抑制率卻低于G1和G2,由于實驗室條件受限,目前尚不能對此現(xiàn)象進(jìn)行準(zhǔn)確解釋。

從圖5、圖6來看,聚古羅糖醛酸和聚甘露糖醛酸對超氧自由基的抑制能力,低于肌肽,高于甘露醇,而且聚古羅糖醛酸在相同濃度下要稍高于聚甘露糖醛酸。這與Ueno[16]的結(jié)果相符,Ueno通過酸法制備了平均聚合度在20～24的,發(fā)現(xiàn)兩者對于超氧自由基的均具有明顯的抑制作用并與樣品的濃度有關(guān),而且聚甘露糖醛酸的清除能力高于聚古羅糖醛酸。

2.4褐藻膠酸降解物還原糖的含量與清除羥自由基(·OH)能力之間的關(guān)系

測定甘露糖醛酸(M1、M2和M3)以及聚古羅糖醛酸(G1、G2和G3)對羥自由基(·OH)的清除率,結(jié)果如圖7和圖8所示。

圖7　不同還原糖含量的聚甘露糖醛酸樣品對羥自由基的清除作用Fig.7　Inhibitory rate on hydroxyl radicals by M1,M2,M3,mannite,carnosine

圖8　不同還原糖含量的聚古羅糖醛酸樣品對羥自由基的清除作用Fig.8　Inhibitory rate on hydroxyl radicals by G1,G2,G3,mannite,carnosine

3　結(jié)論

對于聚古羅糖醛酸和聚甘露糖醛酸,因為多糖還原性較低,通過還原糖的含量可以間接的表明樣品的平均聚合度,從而探究不同聚合度的寡糖抗氧化能力。隨著降解時間的延長,聚古羅糖醛酸和聚甘露糖醛酸的平均聚合度越低。

在聚古羅糖醛酸和聚甘露糖醛酸對于DPPH,自由基、超氧自由基和羥自由基的抑制實驗中,基本符合隨著兩種糖醛酸的濃度上升,三種自由基的清除作用逐漸增強;以及隨著兩種糖醛酸的平均聚合度的降低,三種自由基的清除作用逐漸增強的規(guī)律。但是在聚甘露糖醛酸對于羥自由基的抑制實驗中,所得到的實驗結(jié)果與規(guī)律不符合,同時聚古羅糖醛酸和聚甘露糖醛酸對于羥自由基的抑制在較低濃度下不明顯,即對于羥自由基的抑制作用,還原糖的最低限比較高,這可能是聚甘露糖醛酸對于羥自由基的抑制規(guī)律不明顯的可能原因,有待于進(jìn)一步驗證。

通過對褐藻寡聚糖抗氧化性的研究,發(fā)現(xiàn)了其在抗氧化性方面的獨特功效,對于未來的生物制藥及保健品生產(chǎn)具有一定的輔助功效,而褐藻類海洋生物的巨大產(chǎn)量則是其量產(chǎn)化的重要保障,因此對于褐藻寡聚糖的研究將成為其重點研究方向之一。

[1]Kono Y,Shibata H,Kodama Y,et al. Chlorogenic acid as a natural scavenger for hypochlorous acid[J]. Biochemical and Biophysical Research Communications,1995,217(3):972-978.

[2]Kehrer J P. Free radicals as mediators of tissue injury and disease[J]. CRC Critical Reviews in Toxicology,1993,23(1):21-48.

[3]Valko M,Leibfritz D,Moncol J,et al. Free radicals and antioxidants in normal physiological functions and human disease[J]. The International Journal of Biochemistry & Cell Biology,

2007,39(1):44-84.

[4]Haug A,Larsen B,Smidsr?d O. A study of the constitution of alginic acid by partial acid hydrolysis[J]. Acta Chem Scand,1966,20(1):183-190.

[5]Luan L Q,Nagasawa N,Ha V T T,et al. Enhancement of plant growth stimulation activity of irradiated alginate by fractionation[J]. Radiation Physics and Chemistry,2009,78(9):796-799.

[6]董曉莉,耿美玉,管華詩,等. 褐藻酸性寡糖對帕金森病大鼠紋狀體,杏仁核多巴胺釋放的影響[J]. 中國海洋藥物,2003,95(5):9-12.

[7]Iwamoto M,Kurachi M,Nakashima T,et al. Structure-activity relationship of alginate oligosaccharides in the induction of cytokine production from RAW264. 7 cells[J]. FEBS Letters,2005,579(20):4423-4429.

[8]Iwamoto Y,Xu X,Tamura T,et al. Enzymatically depolymerized alginate oligomers that cause cytotoxic cytokine production in human mononuclear cells[J]. Bioscience,Biotechnology,and Biochemistry,2003,67(2):258-263.

[10]孫麗萍,薛長湖,許家超,等. 褐藻膠寡糖體外清除自由基活性的研究[J]. 中國海洋大學(xué)學(xué)報：自然科學(xué)版,2005,35(5):811-814.

[11]Haug A,Larsen B R,Smidsrod O. Studies on the sequence of uronic acid residues in alginic acid[J]. Acta Chem Scand,1967,21:691-704.

[12]張洪榮,王長云,劉斌,等. 一種飽和褐藻膠寡糖的制備方法[J]. 中國海洋藥物,2006,25(3):1-6.

[13]張惟杰. 糖復(fù)合物生化研究技術(shù)[M]. 杭州:浙江大學(xué)出版社,1994.

[14]陸瑤,陳國華. 肌肽抗氧化機理及其生物活性研究現(xiàn)狀[J]. 四川理工學(xué)院學(xué)報：自然科學(xué)版,2007,20(3):57-60.

[16]Ueno M,Hiroki T,Takeshita S,et al. Comparative study on antioxidative and macrophage-stimulating activities of polyguluronic acid(PG)and polymannuronic acid(PM)prepared from alginate[J]. Carbohydrate Research,2012,352:88-93.

Antioxidant evaluation of alginate oligosaccharides prepared by acid hydrolysis with different conditions

HU Bo-yang1,NIE Ying2,SUN Lu3,NIRASAWA Satoru4,YIN Li-jun3, ZHOU Hui5,LI Mo-li1,CHENG Yong-qiang3,*

(1.College of Bioscience and Biotechnology,Hunan Agricultural University,Changsha 410128,China; 2.Institute of Agro-Products Processing Science and Technology CAAS,Key Laboratory of Agro-Products Processing,Ministry of Agriculture,Beijing 100193,China; 3.Beijing Key Laboratory of Functional Food from Plant Resources,College of Food Science and Nutritional Engineering, China Agricultural University,Beijing 100083,China; 4.Japan International Research Center for Agricultural Sciences,Tsukuba 305-8686,Japan; 5.College of Food Science and Technology,Hunan Agricultural University,Changsha 410128,China)

Polymannuronates and polyguluronates were prepared from alginate,and subsequently treated with hydochloric acid for 1 h,2 h and 6 h to obtain mannuronic acid oligomers(M1、M2and M3)and guluronic acid oligomers(G1、G2and G3). Besides,carnosine and mannose were used as control to evaluate the scavenging effect of oligosaccharide on the DPPH,superoxident radical and hydroxyl radical. The results showed that Polymannuronates and Polyguluronates had strong scavenging effects on DPPH and superoxident radical,and the scavenging effect became more efficient with the increasing concentration of oligosaccharide. M3had stronger effects than carnosine on scavenging DPPH. G3was similar with carnosine referring to scavenging effect. M3had a greater effect than M2and M1on scavenging superoxident radical,while G3was slightly lower than carnosine. Polymannuronates and Polygluronates showed less effect on scavenging hydroxyl radical than carnosine and mannite. According to the data,the average degree of polymerization of alginate oligosaccharides had a greater effect on antioxidant ability.

antioxidation;acidic hydrolysis;alginate;alginate oligosaccharides

2015-10-19

胡博旸(1994-)，男，本科，研究方向：生物工程，E-mail:1320316538@qq.com。

程永強(1972-)，男，教授，研究方向：食品生物技術(shù)與功能食品，E-mail:chengyq@cau.edu.cn。

國家“十二五”科技支撐計劃項目(2014BAD04B06);國家自然科學(xué)基金項目(31171738)。

TS201.1

A

1002-0306(2016)10-0136-05

10.13386/j.issn1002-0306.2016.10.018