范光明
[摘要] 目的 探討哮喘患兒?jiǎn)蝹€(gè)核細(xì)胞FOXP3 mRNA表達(dá)應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR檢測(cè)的臨床意義。 方法 選取來(lái)本院就診的29例哮喘患兒和24例正常健康兒童作為對(duì)照,對(duì)兩組病例應(yīng)用流式細(xì)胞儀檢測(cè)外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMCs)中CD4+CD25+Treg的比例,并鑒定PCR產(chǎn)物特異性。 結(jié)果 哮喘患兒組CD4+CD25+Treg檢測(cè)結(jié)果為(8.26±2.04)%,顯著低于對(duì)照組(12.71±2.53)%,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。哮喘患兒組FOXP3/β-actin的2-△Ct值為(0.49±0.15),對(duì)照組為(0.62±0.18),兩者比較,有顯著性差異(P<0.05)。外周血單個(gè)核細(xì)胞中FOXP3 mRNA表達(dá)與淋巴細(xì)胞中CD4+CD25+Treg比例呈正相關(guān)(r=0.679,P<0.05)。經(jīng)融解曲線分析顯示FOXP3和β-actin均僅有單一擴(kuò)增產(chǎn)物。 結(jié)論 對(duì)于哮喘患兒?jiǎn)蝹€(gè)核細(xì)胞FOXP3 mRNA表達(dá)水平應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR檢測(cè),方法簡(jiǎn)便,結(jié)果穩(wěn)定、可靠。
[關(guān)鍵詞] 哮喘;單個(gè)核細(xì)胞;FOXP3 mRNA;CD4+CD25+Treg;實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR
[中圖分類(lèi)號(hào)] R446.43 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] B [文章編號(hào)] 2095-0616(2013)08-125-02
CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Treg)是一群具有免疫抑制功能的T細(xì)胞,在CD4+CD25+Treg上可見(jiàn)FOXP3特異性高水平表達(dá),它具有反映CD4+CD25+Treg的活性水平[1-3]。研究表明,CD4+CD25+Treg與哮喘的發(fā)生和發(fā)展有著密切關(guān)系,CD4+CD25+Treg能夠?qū)h2細(xì)胞的活化起到抑制作用[4]。本研究探討了哮喘患兒?jiǎn)蝹€(gè)核細(xì)胞FOXP3 mRNA表達(dá)應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR檢測(cè)的臨床意義。
1 資料與方法
1.1 一般資料
選取于本院就診的29例經(jīng)哮喘診斷標(biāo)準(zhǔn)[5]確診的哮喘患兒,其中男19例,女10例;年齡3~14歲,平均(6±2)歲;哮喘病程2~8年。并選取24例正常無(wú)過(guò)敏性疾病史的健康兒童作為對(duì)照組,其中男15例,女9例;年齡3~13歲,平均(6.0±1.5)歲。兩組性別、年齡等一般資料經(jīng)比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),具有可比性。
1.2 方法
采集靜脈血4 mL,分別裝入兩支EDTA抗凝試管中,各2 mL。應(yīng)用流式細(xì)胞儀檢測(cè)外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMCs)中CD4+CD25+Treg的比例,采用融解曲線和瓊脂糖電泳鑒定PCR產(chǎn)物特異性,包括引物設(shè)計(jì)、淋巴細(xì)胞分離、逆轉(zhuǎn)錄、熒光定量PCR反應(yīng)體系、擴(kuò)增產(chǎn)物電泳分析。
1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理
采用SPSS15.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件,計(jì)量資料采用()表示,采用t檢驗(yàn),計(jì)數(shù)資料采用x2檢驗(yàn),P<0.05為差異有顯著性意義。
2 結(jié)果
2.1 熒光定量方法學(xué)評(píng)價(jià)
2.1.1 特異性 FOXP3和β-actin擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)電泳后出現(xiàn)約176bp和205bp兩條特異性條帶,經(jīng)融解曲線分析顯示FOXP3和β-actin均只有一個(gè)尖峰,分別是82.4℃解鏈溫度和87.8℃解鏈溫度,說(shuō)明FOXP3和β-actin分別僅有一擴(kuò)增產(chǎn)物。
2.1.2 稀釋逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物 10倍稀釋逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物cDNA,0.637/反應(yīng)為最低檢測(cè)限,0.637~0.796/反應(yīng)為線性范圍,相當(dāng)于Ct值18-37跨度,r=0.98。
2.1.3 精密度 重復(fù)測(cè)定Ct值為21和Ct值為35的2份標(biāo)本,結(jié)果經(jīng)對(duì)數(shù)處理后其批內(nèi)CV值為1.6%~2.8%,批間CV值為2.5%~6.7%。見(jiàn)圖1。
圖1 精密度測(cè)定
2.2 兩組CD4+CD25+Treg結(jié)果比較
哮喘患兒組CD4+CD25+Treg檢測(cè)結(jié)果為(8.26±2.04)%,對(duì)照組為(12.71±2.53)%,兩組比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。
2.3 兩組FOXP3/β-actin的2-△Ct值比較
哮喘患兒組FOXP3/β-actin的2-△Ct值為0.49±0.15,對(duì)照組為0.62±0.18,兩者比較,有顯著性差異(P<0.05)。
2.4 FOXP3 mRNA與CD4+CD25+Treg的相關(guān)性
外周血單個(gè)核細(xì)胞中FOXP3 mRNA表達(dá)與淋巴細(xì)胞中CD4+CD25+Treg比例呈正相關(guān)(r=0.679,P<0.05)。
3 討論
與普通PCR比較,SYBR Green I實(shí)時(shí)定量PCR具有特異、快速、敏感特點(diǎn)。SYBR Green I實(shí)時(shí)定量PCR無(wú)需合成特異探針,故而使用方便,但非特異產(chǎn)物可干擾靶基因的產(chǎn)物定量。作為一種熒光染料,SYBR Green I能與雙鏈DNA非特異性結(jié)合并發(fā)出熒光,其與游離狀態(tài)熒光強(qiáng)度相比強(qiáng)百余倍,因此可以通過(guò)檢測(cè)熒光強(qiáng)度來(lái)檢測(cè)出雙鏈DNA數(shù)量。但檢測(cè)熒光強(qiáng)度也會(huì)出現(xiàn)假陽(yáng)性結(jié)果,這是因?yàn)榉翘禺愋詳U(kuò)增或引物二聚體也可以產(chǎn)生熒光,從而干擾檢測(cè)結(jié)果。鑒于假陽(yáng)性結(jié)果的出現(xiàn),本研究為了區(qū)別是由PCR產(chǎn)物產(chǎn)生的熒光信號(hào)還是本底造成的熒光信號(hào),在定量反應(yīng)結(jié)束后特別進(jìn)行了融解曲線分析。由于在融解曲線上PCR產(chǎn)物是單一峰,Tm值也較非目的產(chǎn)物要高[9],因此可以通過(guò)分析融解曲線來(lái)證實(shí)擴(kuò)增產(chǎn)物的特異性。本研究結(jié)果顯示,特異性FOXP3和β-actin擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)融解曲線分析顯示FOXP3和β-actin均只有一個(gè)尖峰,分別是82.4℃解鏈溫度和87.8℃解鏈溫度,說(shuō)明其擴(kuò)增的特異性。
研究報(bào)道,兒童支氣管哮喘發(fā)病機(jī)制中免疫功能紊亂起著不容忽視的作用,目前關(guān)注的焦點(diǎn)在于淋巴細(xì)胞亞群的比例和功能紊亂。哮喘發(fā)病與免疫耐受的破壞和Th1/Th2功能失調(diào)有關(guān)。研究認(rèn)為,CD4+CD25+Treg水平和功能的正常維持對(duì)良好的免疫耐受狀態(tài)建立有很好的作用,從而對(duì)哮喘的發(fā)生和發(fā)展起到阻止作用[6]。FOXP3作為一種特殊的轉(zhuǎn)錄因子,在CD4+CD25+Treg上特異性高水平表達(dá),它可以反映CD4+CD25+Treg的活性水平[7-8]。本研究結(jié)果顯示,在外周血CD4+CD25+Treg的比例及FOXP3 mRNA的表達(dá)上哮喘患兒組較對(duì)照組低,表明因CD4+CD25+Treg數(shù)量不足,以致免疫抑制功能降低,效應(yīng)性CD4+T細(xì)胞活化,特別是Th2細(xì)胞,大量致炎因子產(chǎn)生,從而使哮喘發(fā)作或持續(xù)。因此我們猜測(cè),CD4+CD25+Treg與哮喘的發(fā)生和發(fā)展關(guān)系密切,對(duì)CD4+CD25+Treg的檢測(cè)將有助于哮喘患兒的診斷和治療。本研究結(jié)果還顯示,外周血CD4+CD25+Treg細(xì)胞數(shù)量和FOXP3 mRNA表達(dá)有相同的趨勢(shì),存在一定的相關(guān)性。因此,這種從外周血單個(gè)核細(xì)胞中檢測(cè)FOXP3 mRNA的方法簡(jiǎn)單,重復(fù)性好,敏感性和特異性較高,值得推廣。
[參考文獻(xiàn)]
[1] Fontenot JD,Gavin MA,Rudensky AY.Foxp3 programs thedevelopment and function of CD4+CD25+ regulatory T cells[J].Nat Immunol,2003,4(1):330-336.
[2] Khattri R,Cox T,Yasayko SA,et al.An essential role forscurfin in CD4+CD25+ T regulatory cells[J].Nat Immunol,2003,4(2):337-342.
[3] Mochizuki H,Shigeta M,Morikawa A.Develepment of bron-chial hyperresponsiveness during childhood[J].J Asthma,2001,38(1):1-21.
[4] 中華醫(yī)學(xué)會(huì)兒科學(xué)分會(huì)呼吸學(xué)組.兒童支氣管哮喘防治常規(guī)(試行)[J].中華兒科雜志,2004,42(1):100-106.
[5] Seroogy CM,Gern JE.The role of T regulatory cells in asthma[J].Allergy Clin Immunol,2005,116(2):996-999.
[6] Picca CC,Caton AJ.The role of self-peptides in the develop-ment of CD4+CD25+ regulatory T cells[J].Curr OpinImmunol,2005,17(2):131-136.
[7] Yi H,Zhen Y,Jiang L,et al.The phenotypic characterizationof naturally occurring regulatory CD4+CD25+ T cells[J].Cell Mol Immunol,2006,3(1):189-195.
(收稿日期:2013-01-08)