中空海藻酸鈣固定化白色鏈霉菌轉(zhuǎn)化去氫表雄酮的研究

公亮亮??張露露??張松??劉新利

[摘要] 目的 利用生物轉(zhuǎn)化方法來生產(chǎn)具有抗氧化和抗腫瘤活性藥物羥基化去氫表雄酮。方法 利用中空海藻酸鈣膠囊對(duì)白色鏈霉菌進(jìn)行固定化，然后用此固定化菌對(duì)甾體類藥物去氫表雄酮（DHEA）進(jìn)行生物轉(zhuǎn)化，并對(duì)固定化菌的轉(zhuǎn)化條件進(jìn)行優(yōu)化，以期獲得高產(chǎn)量的羥基化DHEA。結(jié)果 中空海藻酸鈣膠囊制備的固定化白色鏈霉菌對(duì)DHEA具有轉(zhuǎn)化作用，并且可以通過固定化白色鏈霉菌的二次轉(zhuǎn)化來實(shí)現(xiàn)羥基化DHEA產(chǎn)率的提高，我們同時(shí)獲得了固定化白色鏈霉菌的最優(yōu)轉(zhuǎn)化條件：對(duì)生長(zhǎng)兩天的白色鏈霉菌進(jìn)行固定化，溫度35℃，pH值7.0，轉(zhuǎn)速150 r/min，轉(zhuǎn)化時(shí)間3 d。結(jié)論 采用固定化白色鏈霉菌轉(zhuǎn)化DHEA方法可行，而且此種方法具有廣泛的工業(yè)應(yīng)用價(jià)值。

[關(guān)鍵詞] 中空海藻酸鈣膠囊；白色鏈霉菌；固定化

[中圖分類號(hào)] Q93 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 2095-0616（2013）08-65-04

甾體類藥物去氫表雄酮（dehydroepiandrosterone，DHEA）是一種C19腎上腺甾體類藥物，主要具有抗癌、延緩衰老及免疫調(diào)節(jié)等作用[1]。以其為中間體能合成更多有重要生理活性的甾體類藥物，如抗氧化活性及抗腫瘤作用更顯著的藥物羥基化DHEA[2]。但是利用化學(xué)合成法合成羥基化DHEA成本太高，而且會(huì)產(chǎn)生很多副產(chǎn)物。因此，利用生物法對(duì)DHEA進(jìn)行轉(zhuǎn)化以獲得藥物羥基化DHEA可以有效的節(jié)約成本[3]，尤其是可進(jìn)行連續(xù)發(fā)酵的固定化細(xì)胞的生物轉(zhuǎn)化越來越受到人們的青睞[4]。在微生物的固定化過程中，非常有效的一種固定化材料是中空海藻酸鈣膠囊。中空海藻酸鈣膠囊是起源于海藻酸鈣凝膠珠的一種固定化體系，是一種有廣闊發(fā)展前景的新型微膠囊體系[5]。本研究以中空海藻酸鈣膠囊為載體，實(shí)現(xiàn)了對(duì)白色鏈霉菌的有效固定化，而且獲得的固定化細(xì)胞可用來生物轉(zhuǎn)化DHEA生成藥物羥基化DHEA，并對(duì)固定化白色鏈霉菌轉(zhuǎn)化DHEA的條件進(jìn)行了優(yōu)化，以提高產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化率。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 菌種

白色鏈霉菌，由山東省微生物工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室菌種保藏中心保藏。

1.2 培養(yǎng)基

斜面培養(yǎng)基PDA（g/L）：馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，瓊脂15 g，pH自然；轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基PDB（g/L）：馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，pH自然。

1.3 材料和試劑

去氫表雄酮（武漢合中生化制造有限公司）；乙酸乙酯（分析純，天津市廣成試劑有限公司）；氯仿（分析純，天津市大茂化學(xué)試劑廠）；顯色劑：10%硫酸-乙醇溶液；CaCl2（分析純，天津市風(fēng)船化學(xué)試劑有限公司）；海藻酸鈉（化學(xué)純，天津市大茂化學(xué)試劑廠）；羧甲基纖維素鈉（化學(xué)純，天津環(huán)宇紅星食品貿(mào)易有限公司）。

1.4 實(shí)驗(yàn)儀器

DHZ-DA型全溫?fù)u床（江蘇太倉市實(shí)驗(yàn)設(shè)備廠）；LDZX-50KB立式電熱壓力蒸汽滅菌鍋（上海申安醫(yī)療器械廠）；SW-CJ-IB超凈工作臺(tái)（蘇州凈化設(shè)備有限公司）；ZF-2型三相紫外分析儀（上海安亭電子儀器廠）；RE-52旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海亞榮生化儀器廠）；90-2型定時(shí)恒溫磁力攪拌器（上海天平儀器廠）；J232D-Epson perfection V330 Photo 掃描儀（上海家佳樂計(jì)算機(jī)網(wǎng)絡(luò)有限公司）。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 中空海藻酸鈣膠囊的預(yù)制備與優(yōu)化

將羧甲基纖維素鈉加入到蒸餾水中加熱煮沸使其溶解，然后向此溶液中加入CaCl2，將此混合液攪拌均勻作為陽離子溶液。將海藻酸鈉（SA）加入到含蒸餾水的三角瓶中，加熱煮沸使其完全溶解，自然降溫待用。將上述制備好的陽離子溶液用注射器逐滴加入到SA溶液中，攪拌5～10 min，過濾獲得膠囊。將獲得的膠囊用無菌水洗凈，然后再放入到1%（m/v，g/100 mL）的CaCl2溶液中繼續(xù)攪拌約20 min左右，進(jìn)一步固定化微膠囊的外表面。然后，再次用蒸餾水清洗以除去膠囊表面的Ca2+，最后將膠囊浸于4℃的蒸餾水中備用[6]。通過單因素實(shí)驗(yàn)，對(duì)SA濃度、CMC濃度、CaCl2濃度、滴加速度、攪拌時(shí)間、針頭孔徑、滴加高度和搖床培養(yǎng)時(shí)間等進(jìn)行優(yōu)化，確定膠囊制備的最佳條件，以獲得膠囊最佳的形狀和機(jī)械強(qiáng)度。

2.2 中空海藻酸鈣固定化白色鏈霉菌轉(zhuǎn)化DHEA的驗(yàn)證

膠囊的制備過程如實(shí)驗(yàn)方法2.1。固定化白色鏈霉菌時(shí)，只要將培養(yǎng)兩天的白色鏈霉菌與CaCl2/CMC陽離子溶液混和均勻，然后用此溶液滴制微膠囊即可。固定化好的白色鏈霉菌添加到含有60 mL的液體PDA培養(yǎng)基中，再加入600μL的1 mg/mL的丙酮溶解的DHEA，然后放入到搖床上生物轉(zhuǎn)化3 d。轉(zhuǎn)化結(jié)束后，對(duì)發(fā)酵液進(jìn)行乙酸乙酯萃取、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮、TLC點(diǎn)板，分別在三用紫外儀（波長(zhǎng)：253.7 nm）和顯色（顯色劑：硫酸：乙醇=1∶9）條件下驗(yàn)證白色鏈霉菌經(jīng)過固定化之后對(duì)DHEA是否有轉(zhuǎn)化活性。本實(shí)驗(yàn)分別以自由菌和雜菌對(duì)DHEA的轉(zhuǎn)化作為陽性和陰性對(duì)照，做兩組平行對(duì)照。

2.3 固定化白色鏈霉菌轉(zhuǎn)化DHEA條件優(yōu)化

主要是考察溫度、pH、轉(zhuǎn)速、轉(zhuǎn)化時(shí)間、固定化菌的生長(zhǎng)狀態(tài)對(duì)固定化白色鏈霉菌轉(zhuǎn)化DHEA的影響。實(shí)驗(yàn)過程利用單因素實(shí)驗(yàn)，設(shè)置不同的影響因素梯度，考察各個(gè)因素對(duì)固定化白色鏈霉菌轉(zhuǎn)化DHEA的影響，產(chǎn)物7α和7β-OH-DHEA通過薄層掃描儀（TLCS）來定性定量分析[7]。

2.4 固定化白色鏈霉菌的重復(fù)利用

固定化白色鏈霉菌一次轉(zhuǎn)化完成后，對(duì)發(fā)酵液進(jìn)行分離，然后將固定化菌用無菌水多次洗滌，清洗完的蒸餾水跟分離得到的發(fā)酵液一起進(jìn)行萃取，濃縮，TLC點(diǎn)板和轉(zhuǎn)化率的確定。清洗完成后再將固定化菌加入到含有600μL DHEA（1 mg/mL）和60 mL PDA液體培養(yǎng)基的250 mL三角瓶中進(jìn)行二次轉(zhuǎn)化，轉(zhuǎn)化3 d。以同樣的方法進(jìn)行3次轉(zhuǎn)化。轉(zhuǎn)化完成后測(cè)定各次轉(zhuǎn)化對(duì)DHEA的轉(zhuǎn)化率。

3 結(jié)果與分析

3.1 中空海藻酸鈣膠囊的制備與優(yōu)化

實(shí)驗(yàn)通過將CMC和CaCl2組成的陽離子溶液向SA溶液中滴加，成功完成了中空海藻酸鈣膠囊的制備，獲得的中空海藻酸鈣膠囊如圖1。

球形的膠囊有利于保持膠囊的均勻，從而有助于營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的均勻擴(kuò)散和產(chǎn)物的有效排出。而一定機(jī)械強(qiáng)度的膠囊可以防止膠囊在搖床上培養(yǎng)菌時(shí)破裂，菌體外泄。通過單因素實(shí)驗(yàn)獲得最佳的膠囊制備條件：SA濃度1%（w/v，1g/100 mL，下同）、CMC濃度1%、CaCl2濃度8%、滴加速度210滴/min、攪拌時(shí)間20 min、滴加高度8 cm、大孔徑的針頭。在此最優(yōu)條件下膠囊的成球能力很好，直徑：（10.0±1.2）mm， 內(nèi)徑：（8.2±0.9）mm，厚度：（0.9±0.13）mm，機(jī)械強(qiáng)度：（11.50±1.8）N。

3.2 中空海藻酸鈣固定化白色鏈霉菌轉(zhuǎn)化DHEA

采用3.1中制備膠囊的最佳條件，完成了對(duì)白色鏈霉菌菌體的固定化如圖2[8]。由結(jié)果可知，充滿白色鏈霉菌菌體的膠囊呈現(xiàn)黃色，不透明，這與空的中空海藻酸鈣膠囊對(duì)比明顯。將上述固定化膠囊加入含有60 mL液體PDA培養(yǎng)基的250 mL三角瓶中，再加入DHEA進(jìn)行生物轉(zhuǎn)化，分別在三用紫外儀和顯色條件下獲得的轉(zhuǎn)化結(jié)果如圖3。固定化白色鏈霉菌對(duì)DHEA具有轉(zhuǎn)化作用，雖然相對(duì)于自由菌其轉(zhuǎn)化率偏低，但是固定化白色鏈霉菌對(duì)DHEA表現(xiàn)出了明顯的轉(zhuǎn)化。因此通過白色鏈霉菌固定化的方法來實(shí)現(xiàn)DHEA的生物轉(zhuǎn)化是可行的，并且可以通過條件優(yōu)化和固定化菌的重復(fù)利用來實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)化率的提高[9]。

3.3 固定化白色鏈霉菌轉(zhuǎn)化DHEA條件優(yōu)化

利用單因素實(shí)驗(yàn)測(cè)定了溫度、pH、轉(zhuǎn)速、轉(zhuǎn)化時(shí)間、固定化的自由菌的生長(zhǎng)狀態(tài)對(duì)固定化白色鏈霉菌轉(zhuǎn)化DHEA的影響結(jié)果如圖4。各因素對(duì)固定化白色鏈霉菌轉(zhuǎn)化DHEA的結(jié)果影響很大。通過對(duì)各因素優(yōu)化之后，固定化白色鏈霉菌對(duì)DHEA的轉(zhuǎn)化率達(dá)到40%左右，使得其轉(zhuǎn)化率有一個(gè)明顯的提高。實(shí)驗(yàn)過程獲得的最優(yōu)轉(zhuǎn)化條件為：對(duì)生長(zhǎng)兩天的白色鏈霉菌進(jìn)行固定化，溫度為35℃，pH為7，轉(zhuǎn)速為150 r/min，轉(zhuǎn)化時(shí)間為3 d。

3.4 固定化白色鏈霉菌的重復(fù)利用

將固定化好的白色鏈霉菌分別進(jìn)行一次、二次和三次轉(zhuǎn)化，以實(shí)現(xiàn)固定化白色鏈霉菌的重復(fù)利用，從而達(dá)到羥基化DHEA的高產(chǎn)率。不同的轉(zhuǎn)化次數(shù)對(duì)DHEA的轉(zhuǎn)化率見圖5。固定化白色鏈霉菌對(duì)DHEA的第一次轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)化率為37%，二次轉(zhuǎn)化率為50%，三次轉(zhuǎn)化率為13%。固定化菌的二次轉(zhuǎn)化能力較強(qiáng)，三次轉(zhuǎn)化能力較弱。造成這種結(jié)果的原因可能是剛固定化好的白色鏈霉菌在膠囊內(nèi)經(jīng)過一個(gè)延遲過程，再加上第一次分離時(shí)，產(chǎn)物可能在膠囊內(nèi)不能充分釋放，導(dǎo)致一次獲得的轉(zhuǎn)化率低于二次轉(zhuǎn)化獲得的轉(zhuǎn)化率。而菌體的老化以及膠囊表面附著的培養(yǎng)基等造成膠囊部分堵塞可能是導(dǎo)致三次轉(zhuǎn)化率降低的原因[10]。

圖5 固定化白色鏈霉菌的重復(fù)利用

4 討論

近年來，甾體類藥物的應(yīng)用領(lǐng)域不斷擴(kuò)大，尤其是其在醫(yī)藥工業(yè)中的廣泛應(yīng)用，使其成為市場(chǎng)化程度較高的醫(yī)藥產(chǎn)品之一，而且甾體類藥物已經(jīng)是僅次于抗生素的第2大類藥物[11]。在這些甾體類藥物中，DHEA是很重要的一員，它可以來源豐富、價(jià)格低廉的薯蕷皂苷元為原料，經(jīng)簡(jiǎn)單的化學(xué)合成法而得。此外，以其為中間體獲得的羥基化DHEA可以提高肌體免疫力，具有明顯的免疫調(diào)節(jié)能力，對(duì)B淋巴細(xì)胞也有顯著的抑制作用。它們還可以延緩衰老，保持青春活力，增強(qiáng)體能，改善情緒和睡眠，提高記憶力等，因此是一種具有較大發(fā)展前景的藥物[12]。利用中空海藻酸鈣膠囊固定化細(xì)胞對(duì)DHEA進(jìn)行生物轉(zhuǎn)化來獲得藥物羥基化DHEA能有效的提高目標(biāo)產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化率，并且可以實(shí)現(xiàn)固定化菌的重復(fù)利用，可以更好的對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行分離，同時(shí)還能大量的節(jié)約成本，是一種非常有潛力的生物轉(zhuǎn)化方法。

本研究中，利用中空海藻酸鈣膠囊對(duì)DHEA的轉(zhuǎn)化菌株白色鏈霉菌實(shí)現(xiàn)了較好的固定化，并且證實(shí)固定化白色鏈霉菌對(duì)DHEA仍保留轉(zhuǎn)化活性。而且，經(jīng)過單因素實(shí)驗(yàn)的優(yōu)化實(shí)現(xiàn)了固定化白色鏈霉菌對(duì)DHEA轉(zhuǎn)化率的提高，使得固定化菌的轉(zhuǎn)化率從原來的30%左右提升到41%。此外，本研究還實(shí)現(xiàn)了固定化菌的重復(fù)利用，固定化菌的二次轉(zhuǎn)化比一次轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)化率提高了13%，說明了固定化菌的重復(fù)利用情況較好。固定化菌的重復(fù)利用不僅提高了固定化白色鏈霉菌的轉(zhuǎn)化率，同時(shí)節(jié)省了孢子懸液的制備和固定化等過程，有效的節(jié)約了成本以及固定化菌對(duì)DHEA的轉(zhuǎn)化周期。綜上所述，本研究采用中空海藻酸鈣膠囊固定化白色鏈霉菌轉(zhuǎn)化DHEA是一種非常經(jīng)濟(jì)適用的生物轉(zhuǎn)化方法，同時(shí)也為羥基化DHEA的工業(yè)生產(chǎn)提供了理論基礎(chǔ)。

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（收稿日期：2013-03-15）