cyclin D3調(diào)控LN308膠質(zhì)瘤細(xì)胞遷移研究

章倩倩??周惠??屈良鵠??王麗京

[摘要] 目的 探討細(xì)胞周期蛋白D3（CCND3）在LN308膠質(zhì)瘤細(xì)胞中的作用。 方法 根據(jù)NCBI GenBank中cyclin D3序列設(shè)計(jì)雙鏈siRNA，利用western blotting技術(shù)驗(yàn)證設(shè)計(jì)的siRNA序列的有效性，并通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)抑制CCND3對(duì)LN308膠質(zhì)瘤細(xì)胞周期進(jìn)程的影響；通過(guò)transwell檢測(cè)CCND3對(duì)LN308細(xì)胞遷移的影響。 結(jié)果 經(jīng)western blotting檢測(cè)，成功抑制了CCND3的表達(dá)。并且發(fā)現(xiàn)與對(duì)照組相比較，抑制CCND3表達(dá)對(duì)LN308細(xì)胞周期無(wú)影響，但是可以顯著抑制LN308細(xì)胞的遷移。 結(jié)論 LN308細(xì)胞中CCND3并不發(fā)揮調(diào)控細(xì)胞周期的功能，而是影響細(xì)胞的遷移，促進(jìn)腫瘤的發(fā)展。本研究為臨床上靶向治療膠質(zhì)瘤提供了理論基礎(chǔ)。

[關(guān)鍵詞] cyclin D3；膠質(zhì)瘤；細(xì)胞遷移

[中圖分類號(hào)] R739.41 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 2095-0616（2013）08-31-03

神經(jīng)膠質(zhì)瘤是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中最常見(jiàn)的惡性腫瘤，發(fā)病率約占成人顱內(nèi)腫瘤的40%～50%，并且其通過(guò)手術(shù)及放化療治療預(yù)后極差[1-2]。大量研究證實(shí)膠質(zhì)瘤中存在cyclin D1和cyclin D3過(guò)表達(dá)，并且其表達(dá)程度與腫瘤惡性程度和患者預(yù)后相關(guān)[3-9]。然而，cyclin D3在膠質(zhì)瘤中所發(fā)揮的作用報(bào)道較少。因此，確定cyclin D3對(duì)膠質(zhì)瘤發(fā)生、發(fā)展的調(diào)控機(jī)制，有助于進(jìn)一步研究以cyclin D3為靶點(diǎn)的藥物對(duì)膠質(zhì)瘤進(jìn)行治療。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞株

人類神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞株LN308培養(yǎng)于含10%胎牛血清及添加100 U/mL青霉素和100 μg/mL鏈霉素的DMEM高糖培養(yǎng)基。并置于5% CO2培養(yǎng)箱中37℃培養(yǎng)至80%～90%融合后傳代培養(yǎng)，取處于指數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞進(jìn)行試驗(yàn)。

1.2 試劑和儀器

DMEM高糖培養(yǎng)基，胎牛血清，0.25%胰蛋白酶（美國(guó)Gibco公司）；cyclin D3 siRNA（上海吉瑪公司）；CCND3一抗（CST，美國(guó)）；Nocodazole（Sigma公司）；Transwell小室（Corning，美國(guó)）。CO2培養(yǎng)箱（Thermo，美國(guó)）；倒置顯微鏡（Olympus，日本）。

1.3 方法

1.3.1 細(xì)胞分組及轉(zhuǎn)染處理 取指數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板每個(gè)孔接種3×105個(gè)細(xì)胞。分為正常生長(zhǎng)組、空白對(duì)照組（NC）、siRNA組。24 h以后對(duì)細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)染，具體實(shí)驗(yàn)方案參考LipofectaminTM 2000產(chǎn)品使用說(shuō)明書。細(xì)胞接種24 h后吸取培養(yǎng)基，加入無(wú)血清無(wú)雙抗的DMEM培養(yǎng)基2 mL。準(zhǔn)備轉(zhuǎn)染復(fù)合物，溶液A：250μL Opti-MEM培養(yǎng)基+5 μL LipofectaminTM2000，溶液B：250μL Opti-MEM培養(yǎng)基+50μM siRNA，室溫下分別靜置5 min。然后將溶液A與溶液B混合，室溫靜置20 min后加入細(xì)胞中。放入CO2培養(yǎng)箱靜置培養(yǎng)，6 h后換成含血清和雙抗的DMEM培養(yǎng)基。

1.3.2 蛋白免疫印跡 轉(zhuǎn)染siRNA后48 h的細(xì)胞用RIPA裂解蛋白，BCA法檢測(cè)蛋白濃度。每組取60μg總蛋白跑SDS-PAGE，250 v轉(zhuǎn)PVDF膜后5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，4℃一抗封閉過(guò)夜，然后將HRP標(biāo)記二抗室溫孵育1 h，ECL法發(fā)光，暗室曝光、顯影、洗片。

1.3.3 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期 在轉(zhuǎn)染siRNA后24 h的細(xì)胞中加入100 ng/mL Nocodazol將細(xì)胞周期同步化；繼續(xù)培養(yǎng)20 h，收集細(xì)胞培養(yǎng)液及細(xì)胞，離心收集細(xì)胞，加入冰冷的NP40/PI染液及25 mg/mL RNase A，37℃水浴30 min；通過(guò)300目篩網(wǎng)過(guò)濾入流式管中，上機(jī)檢測(cè)。

1.3.4 Transwell檢測(cè)細(xì)胞遷移 細(xì)胞轉(zhuǎn)染50 nM NC或者siRNA同時(shí)將transwell小室放入無(wú)血清，無(wú)雙抗的DMEM培養(yǎng)基中水化。轉(zhuǎn)染后細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)24 h，收集細(xì)胞并計(jì)數(shù)，在transwell小室上室中加入4×104個(gè)細(xì)胞，繼續(xù)培養(yǎng)20 h，然后用1%結(jié)晶紫染色小室下方轉(zhuǎn)移過(guò)去的細(xì)胞，并擦除上室中未轉(zhuǎn)移的細(xì)胞，顯微鏡下觀察拍照。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

細(xì)胞周期分布用Modfit3.0軟件（Verity Software House，Topsham，ME，USA）分析。實(shí)驗(yàn)采用3次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)結(jié)果數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，所得數(shù)據(jù)用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS17.0進(jìn)行分析，數(shù)據(jù)均以（）表示，在進(jìn)行兩組之間的差異分析時(shí)選用雙尾Students t-test，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 驗(yàn)證設(shè)計(jì)的siRNA序列的有效性

參照NCBI GenBank中人類CCND3 cDNA序列設(shè)計(jì)siRNA序列5'-GAUGCUGGCUUACUGGAUGdTdT-3'，對(duì)LN308細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)染，收取蛋白進(jìn)行免疫印跡檢測(cè)。如圖1所示，設(shè)計(jì)的siRNA可以有效抑制CCND3的表達(dá)。

圖1 western blotting檢測(cè)siRNA抑制CCND3表達(dá)

2.2 CCND3對(duì)LN308細(xì)胞周期的影響

轉(zhuǎn)染后細(xì)胞加入100 ng/mL Nocodazole使細(xì)胞周期同步在G2期，檢測(cè)CCND3對(duì)LN308細(xì)胞周期的影響。如圖2所示，CCND3雖然為細(xì)胞周期蛋白，但是其在LN308細(xì)胞中對(duì)細(xì)胞周期并不發(fā)揮調(diào)控作用。

圖2 抑制cyclin D3表達(dá)對(duì)LN308細(xì)胞周期影響

2.3 CCND3對(duì)LN308細(xì)胞遷移的影響

LN308細(xì)胞中抑制CCND3表達(dá)后，通過(guò)Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)LN308細(xì)胞遷移率的變化。如圖3A所示，發(fā)現(xiàn)CCND3下調(diào)后遷移至小室下方的LN308細(xì)胞數(shù)量顯著降低。并且通過(guò)統(tǒng)計(jì)發(fā)現(xiàn)，抑制CCND3的表達(dá)，LN308細(xì)胞遷移到下室的細(xì)胞數(shù)量減少了近60%（圖3B）。

圖3 抑制cyclin D3表達(dá)對(duì)LN308細(xì)胞遷移影響

A：Transwell檢測(cè)抑制CCND3表達(dá)對(duì)細(xì)胞遷移的影響（20×）；B：隨機(jī)取5個(gè)視野，對(duì)陰性對(duì)照組及CCND3 siRNA組細(xì)胞遷移的數(shù)目進(jìn)行統(tǒng)計(jì)

3 討論

近年來(lái)的分子生物學(xué)研究表明，細(xì)胞周期蛋白D家族（cyclin D）包括cyclin D1、cyclin D2和cyclin D3三種亞型，并且cyclin D家族成員在許多腫瘤中均表達(dá)上調(diào)[10]。雖然3種cyclin D家族成員在氨基酸序列上具有高度同源性，但是它們?cè)诮M織和細(xì)胞中卻存在表達(dá)差異。在人腦膠質(zhì)瘤組織中，cyclin D1在膠質(zhì)瘤組織中的表達(dá)顯著高于正常腦組織，而cyclin D3僅在惡性程度較高的腫瘤組織中表達(dá)顯著上調(diào)[3-5]。表明cyclin D3與膠質(zhì)瘤的發(fā)展具有相關(guān)性，但是其在膠質(zhì)瘤中的作用到底如何有待進(jìn)一步探討。

對(duì)于cyclin D1在腫瘤中的功能研究已有大量報(bào)道[11-13]，近年來(lái)對(duì)于cyclin D3失調(diào)在腫瘤發(fā)病過(guò)程中的作用越來(lái)越受到重視，成為腫瘤發(fā)病機(jī)理研究的熱點(diǎn)。本研究明確指出，cyclin D3作為細(xì)胞周期蛋白家族的一員，在LN308膠質(zhì)瘤細(xì)胞中并不對(duì)細(xì)胞周期進(jìn)程進(jìn)行調(diào)控。對(duì)cyclin D3的研究發(fā)現(xiàn)，其與腫瘤的發(fā)生相關(guān)，而且與腫瘤的轉(zhuǎn)移、預(yù)后也密切相關(guān)[14-16]。高表達(dá)cyclin D3患者通常表現(xiàn)出臨床癥狀較重，發(fā)生轉(zhuǎn)移的概率更高，對(duì)傳統(tǒng)化療的敏感性差，生存率低。由于臨床相關(guān)性檢測(cè)發(fā)現(xiàn)cyclin D3僅在高度惡性的膠質(zhì)瘤組織中高表達(dá)[3-5]，因此我們推測(cè)其可能調(diào)控膠質(zhì)瘤細(xì)胞的侵襲。通過(guò)本研究結(jié)果分析，發(fā)現(xiàn)cyclin D3在惡性膠質(zhì)瘤細(xì)胞中能夠調(diào)節(jié)細(xì)胞的遷移，說(shuō)明cyclin D3雖然作為細(xì)胞周期蛋白家族成員，在膠質(zhì)瘤中僅調(diào)控腫瘤細(xì)胞的遷移而促進(jìn)腫瘤的發(fā)展。

膠質(zhì)瘤是最常見(jiàn)的顱內(nèi)惡性腫瘤，膠質(zhì)瘤細(xì)胞生長(zhǎng)速度較快，并且常沿著周圍組織和神經(jīng)纖維浸潤(rùn)性生長(zhǎng)[1-2]。目前對(duì)于膠質(zhì)瘤的治療方法為外科手術(shù)以及放、化療治療，但是難以將其徹底根除。因此，如何有效的治療膠質(zhì)瘤及改善預(yù)后成為目前臨床關(guān)注的一個(gè)焦點(diǎn)?；蛑委熓悄壳爸委熌[瘤的最新治療方法，基于cyclin D3表達(dá)異常在膠質(zhì)瘤的發(fā)展中扮演著重要角色，利用反義cyclin D3對(duì)靶細(xì)胞進(jìn)行基因治療將為膠質(zhì)瘤的治療提供新途徑。

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（收稿日期：2013-04-11）