TIR/BB環(huán)擬似物AS?1對小鼠腎缺血再灌注損傷的保護作用研究

刁愛芹，張光際，王 卉，潘愛萍，袁海建，李建濤

1泰州職業(yè)技術(shù)學(xué)院醫(yī)學(xué)技術(shù)學(xué)院，江蘇 泰州 225300；2南京醫(yī)科大學(xué)病理生理學(xué)系，江蘇 南京 210029

急性腎損傷（acute kidney injury，AKI）是一組以急性腎功能減退為主要表現(xiàn)的臨床綜合征，具有發(fā)病率高、病情兇險、預(yù)后差的特點，嚴重的急性腎損傷會發(fā)展為急性腎衰竭，導(dǎo)致腎功能在短時間內(nèi)急劇減退，腎小球濾過率下降、血肌酐及尿素氮迅速上升，并導(dǎo)致水、電解質(zhì)及酸堿平衡失調(diào)，臨床上能采取的治療措施非常有限，除腎替代治療外尚缺乏有效的治療手段［1-2］。腎缺血再灌注（renal ischemia?reperfusion，RIR）是引起急性腎損傷的常見原因，當(dāng)腎部分切除術(shù)、腎移植、腎積水等手術(shù)恢復(fù)供血供氧時，機體啟動一系列炎癥反應(yīng)、自由基、氧化應(yīng)激等刺激因素，使細胞代謝功能障礙及結(jié)構(gòu)破壞更加嚴重［3-4］。炎癥和細胞凋亡是RIR 損傷常見的病理生理過程，一方面腎缺血再灌注損傷發(fā)生后能激活TLRs介導(dǎo)的信號通路，激活NF?κB介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)，促進一系列炎癥介質(zhì)、細胞因子等的表達，導(dǎo)致腎損傷［5］；另一方面腎短暫缺血缺氧時凋亡是腎小管上皮細胞主要的死亡模式，缺氧時，細胞內(nèi)的凋亡信號通路被激活，眾多與凋亡相關(guān)的基因被誘導(dǎo)表達，而腎小管上皮細胞的調(diào)亡可導(dǎo)致腎組織的結(jié)構(gòu)萎縮和腎細胞數(shù)目的減少，也能導(dǎo)致并加重腎損傷［5-6］。因此，如何減輕炎癥和腎小管上皮細胞凋亡對防治腎缺血再灌注損傷有重要意義。

近年來，研究發(fā)現(xiàn)，一種模擬MyD88和IL?1R/IL?1R 受體同源區(qū)域（toll IL?1 receptor homology，TIR）BB環(huán)狀擬似物氫化肉桂基?L?纈氨酰吡咯烷（hydro?cinnmoy?L?valyl pyrrolidine，AS?1）能發(fā)揮抗炎作用用于退熱［7］，并能改善壓力負荷誘導(dǎo)的心肌肥大［8］、減輕大鼠心肌缺血再灌注損傷［9］，也能保護非酒精性脂肪性肝炎［10］，但其在腎缺血再灌注損傷中是否具有保護作用還不清楚。因此，本研究將采用整體小鼠腎缺血再灌注損傷模型，探討AS?1對腎缺血再灌注損傷是否也具有保護作用，如具有保護作用，其作用機制是否與減輕炎癥和細胞凋亡相關(guān)，以期為臨床開發(fā)防治急性腎損傷或急性腎衰竭類藥物提供理論基礎(chǔ)及實驗依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

SPF級8～10周雄性C57BL/6小鼠，體重18～22 g，由南京醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供，將其置于溫度（22±2）℃、濕度62%～65%、12 h 光照和黑暗交替的房間中，給予標準食物和水喂養(yǎng)。

1.2 方法

1.2.1 模型建立

所有小鼠術(shù)前禁食12 h，自由飲水。用10%水合氯醛（0.4 mL/100 g）腹腔內(nèi)注射麻醉，待麻醉起效時用手術(shù)剪刀剪去腹部鼠毛，然后碘伏消毒，在劍突下約0.5 cm 沿腹正中線切開皮膚和肌肉，暴露腹腔，找到并游離雙側(cè)腎蒂，用無創(chuàng)動脈夾夾閉雙側(cè)腎蒂。觀察腎臟顏色變化，確認血流阻斷，夾閉45 min 后取下動脈夾，小鼠腎臟顏色在短時間內(nèi)由暗褐色逐漸變?yōu)轷r紅色，提示再灌注良好，逐層縫合，蘇醒后繼續(xù)自由飲水，12 h后自由進食。

1.2.2 動物分組

將40 只小鼠隨機分成4 組（n=10）：假手術(shù)組（sham組）、腎缺血再灌注組（RIR 組）、AS?1+腎缺血再灌注組（AS?1+RIR 組）、溶劑+腎缺血再灌注組（溶劑+RIR 組）。各組分別做如下處理：sham 組與手術(shù)組操作一樣，但不夾閉小鼠雙側(cè)腎動、靜脈；RIR 組在小鼠腎臟缺血45 min 后恢復(fù)血液供應(yīng)；AS?1+RIR 組在術(shù)前30 min 按劑量50 mg/kg 腹腔注射AS?1；溶劑+RIR組在術(shù)前30 min按劑量50 mg/kg腹腔注射溶劑。

1.2.3 血清肌酐（Scr）、尿素氮（BUN）測定

術(shù)后24 h取各組小鼠眼球血，靜置后在室溫下離心10 min（3 000 r/min），取上清獲得血清，檢測Scr、BUN。

1.2.4 腎組織HE染色

術(shù)后24 h 處死各組小鼠取腎組織，在10%福爾馬林中固定，病理切片后標準HE染色，在普通光學(xué)顯微鏡下觀察各組腎組織病理變化，通過計算腎小管損傷面積半定量評估腎小管間質(zhì)損傷程度。每張切片在200 倍光鏡下隨機選取皮髓質(zhì)交界部10個不重疊視野觀察腎損傷并評分。評估參數(shù)包括：腎小管上皮細胞變形、壞死，刷狀緣脫落，管型形成，炎癥細胞浸潤。評分標準：1 分（≤10%）；2 分（11%～25%）；3 分（26%～45%）；4 分（46%～75%）；5分（≥76%）［11］。

1.2.5 ELISA法檢測小鼠血清IL?6、TNF?ɑ水平

按ELISA試劑盒說明書操作，取各組小鼠眼球血血清，檢測腎缺血再灌注后24 h的IL?6、TNF?ɑ水平，用多功能微孔板檢測儀（λ=450 nm）測定吸光度（A）。

1.2.6 免疫組織化學(xué)染色

取各組腎組織石蠟切片予以常規(guī)脫蠟處理，煮沸的枸櫞酸緩沖液抗原修復(fù)，免疫組化染色步驟則完全參考SP 的試劑盒說明書進行，CD68 和MPO 抗體濃度均為1∶100。

1.2.7 Western blot

取一定量的腎組織，加入預(yù)冷蛋白裂解液和蛋白磷酸酶抑制劑，充分研磨裂解后，12 000 r/min 離心30 min，取上清液，BCA法測蛋白濃度。蛋白煮沸冷卻后每組取80 μg上樣，經(jīng)電泳、轉(zhuǎn)膜、5%脫脂奶粉溶液封閉1 h 后，加入一抗：Caspase 3（1∶1 000）、Bcl?2（1∶1 000）、Bax（1∶1 000）、p?p65（1∶1 000），4℃封閉孵育過夜（搖床）。次日復(fù)溫30 min，TBST洗膜3次，分別加入相應(yīng)的HRP 標記的二抗（1∶3 000），常溫孵育2 h（搖床），TBST洗膜3次，采用ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒（Thermo公司，美國）顯色曝光。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

采用GraphPad Prism 5 統(tǒng)計軟件分析。計量資料以均數(shù)±標準差（）表示，實驗數(shù)據(jù)經(jīng)單因素方差分析（one?way ANOVA）比較，組間兩兩比較采用q檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 AS?1改善腎缺血再灌注損傷的腎功能。

各組小鼠血清Scr 及BUN 水平比較見表1。與sham 組相比，RIR 組Scr 和BUN 均顯著升高（P＜0.01）。與溶劑+RIR 組相比，AS?1 處理后可以明顯降低腎再灌注損傷后Scr 及BUN 水平（P＜0.01）。與RIR 組相比，溶劑+RIR 組的Scr 和BUN 表達量無明顯變化。

表1 血清Scr及BUN水平Table 1 The levels of serum Scr and BUN（）

表1 血清Scr及BUN水平Table 1 The levels of serum Scr and BUN（）

與sham 組相比，**P<0.01；與RIR 組和溶劑+RIR 組相比，##P<0.01。

2.2 AS?1改善腎缺血再灌注損傷的腎組織形態(tài)。

腎組織HE 染色結(jié)果見圖1。光鏡下sham 組腎小球、腎小管結(jié)構(gòu)清晰，未見明顯炎性細胞浸潤。與sham 組相比，RIR 組腎小球毛細血管瘀血，腎小囊囊腔擴張，腎間質(zhì)毛細血管擴張、彌漫性充血，腎小管擴張嚴重、上皮細胞變形壞死或消失、刷狀邊緣脫落，管壁變薄，部分呈蛋白管型，部分腎小管上皮細胞萎縮，細胞漿內(nèi)可見大小不一的空泡，結(jié)構(gòu)紊亂。AS?1 處理后，腎間質(zhì)毛細血管充血減輕、炎性細胞浸潤減少，上皮細胞變形壞死減少，表明腎組織損傷有所減輕。與RIR組相比，溶劑+RIR組的腎組織損傷沒有明顯變化，仍然損傷較嚴重。

圖1 腎組織病理變化Figur 1 The histopathological changes of kidney tissues

2.3 AS?1 降低腎缺血再灌注損傷的腎組織炎癥因子表達

各組小鼠血清炎癥因子TNF?ɑ、IL?6 表達水平見圖2。腎缺血再灌注損傷后，與sham組相比，RIR組TNF?α的表達量升高了107.22%（86.225±4.277vs.178.671±6.303，n=7，P<0.01），IL?6 的表達量升高了117.68%（101.980±6.159vs.221.994±7.512，n=7，P<0.01）。AS?1 處理后，與溶劑+RIR 組相比，TNF?α的表達量降低了36.67%（178.671±6.303vs.113.144±6.700，n=7，P<0.01），IL?6的表達量降低了29.60%（221.994±7.512vs.156.272±3.652，n=7，P<0.01）。與RIR 組相比，溶劑+RIR 組的TNF?α、IL?6表達量無明顯變化。

圖2 血清炎癥因子的表達水平Figure 2 The levels of serum inflammatory factors

2.4 AS?1 減輕腎缺血再灌注損傷的腎組織CD68+和MPO炎癥細胞浸潤

腎組織CD68+和MPO 免疫組化（圖3）顯示，與sham 組相比，RIR 組CD68+和MPO 炎癥細胞明顯增多。AS?1處理后，炎性細胞浸潤減少。與RIR組相比，溶劑+RIR組的炎性細胞浸潤沒有明顯變化。

圖3 各組小鼠腎臟炎性細胞浸潤情況（免疫組化，×400）Figure 3 Immunohistochemical detection of the infiltration of inflammatory cells in mice kidney of each group（IHC，×400）

2.5 AS?1減輕腎缺血再灌注損傷引起的細胞凋亡

各組小鼠Cleaved caspase3、Bcl?2、Bax的蛋白表達水平見圖4。Western blot 結(jié)果顯示，腎缺血再灌注損傷后，與sham 組相比，RIR 組的Cleaved cas?pase3升高了110.01%（1.000±0.125vs.2.100±0.085，n=3，P<0.01），Bax 的表達量升高了54.47%（1.000±0.050vs.1.545±0.031，n=3，P<0.01），Bcl?2的表達量降低了41.85%（1.000±0.062vs.0.582±0.047，n=3，P<0.01）、Bcl?2/Bax 的比值降低了62.37%（1.000±0.059vs.0.376±0.029，n=3，P<0.01）。與RIR+溶劑組相比，AS?1 處理后，Cleaved caspase3 的表達量下降了22.29%（1.934±0.103vs.1.503±0.060，n=3，P<0.01）、Bax 的表達量下降了26.05%（1.507±0.070vs.1.115±0.031，n=3，P<0.01），Bcl?2 的表達量升高了18.65%（0.566±0.027vs.0.696±0.025，n=3，P<0.01），Bcl?2/Bax 的比值升高了39.78%（0.376±0.018vs.0.624±0.008，n=3，P<0.01）。與RIR 組相比，溶劑+RIR 組的Cleaved caspase3、Bax、Bcl?2、Bcl?2/Bax表達量無明顯變化。

圖4 凋亡指標檢測結(jié)果Figure 4 The results of apoptosis index

2.6 AS?1 抑制腎缺血再灌注損傷的腎組織NF?κBp65的磷酸化

各組小鼠在缺血45 min再灌注24 h后p?p65蛋白表達如圖5 所示，結(jié)果顯示，與sham 組相比，RIR組的p?p65 升高了64.97%（1.000±0.054vs.1.650±0.061，n=3，P<0.01），而經(jīng)AS?1 處理后，與溶劑+RIR 組相比，AS?1 介入后p? p65 的表達量下降了35.41%（1.707±0.036vs.1.103±0.021，n=3，P<0.01）。與RIR組相比，溶劑+RIR組的p?p65表達量無顯著變化。

圖5 NF?κB p65的磷酸化水平Figure 5 The levels of NF?κB p65 phosphorylation

3 討論

本研究探討了TIR/BB 環(huán)擬似物AS?1對小鼠腎缺血再灌注損傷的影響。研究發(fā)現(xiàn)小鼠腎缺血再灌注模型建立后腎功能指標血清Scr和BUN的水平明顯升高，腎組織明顯損傷；同時伴有炎性因子TNF?α、IL?6的表達增加、腎組織炎癥細胞浸潤增多；伴有凋亡相關(guān)因子Cleaved caspase 3、Bax 的表達增加及Bcl?2的表達下降。AS?1可降低腎缺血再灌注引起的血清Scr、BUN 的水平升高，減輕腎組織損傷程度；降低TNF?ɑ、IL?6、Cleaved caspase3、Bax 的蛋白表達及增加Bcl?2的表達，并減少炎性細胞浸潤，發(fā)揮抗炎和抗凋亡作用。

AKI 在臨床非常常見，且患病率呈逐年升高趨勢，發(fā)達國家AKI 的發(fā)病率占入院患者的3.2%～9.6%，病死率占入院患者的20%，在ICU患者中病死率甚至達到50%，全球每年死于AKI 的患者有近200 萬［1］。腎臟缺血再灌注損傷是腎臟外科手術(shù)中無法避免的病理生理過程，也是引起術(shù)后AKI 或腎功能不全的主要原因，因此減輕腎臟缺血再灌注損傷是目前臨床研究的熱點，相關(guān)實驗性研究有著重要的臨床治療指導(dǎo)意義。已有研究報道提示，TIR/BB 環(huán)擬似物AS?1 主要通過抑制IL?1R 與MyD88 的結(jié)合發(fā)揮其調(diào)控多種病理生理學(xué)進程的作用，Zhu等［8］發(fā)現(xiàn)AS?1 可以抑制心肌肥大誘導(dǎo)的NF?κB 結(jié)合活性的增加及MAPK 信號的激活，同時抑制心肌肥大誘導(dǎo)的細胞凋亡，發(fā)揮心臟保護作用；Cao 等［9］研究發(fā)現(xiàn)AS?1 能抑制心肌缺血再灌注損傷誘導(dǎo)的NF?κB 的核轉(zhuǎn)錄活性，降低心肌組織中炎性因子（IL?1α、IL?1β、IL?6、TNF?α）的表達水平，保護缺血再灌注引起的心功能損傷。周揚等［10］研究也發(fā)現(xiàn)AS?1 能減少創(chuàng)傷失血性休克大鼠再灌注引起的IL?1β、TNF?α的表達發(fā)揮肝臟保護作用。因此，本文考慮研究AS?1 對腎缺血再灌注的保護作用。本研究依據(jù)相關(guān)文獻報道采用左、右腎蒂結(jié)扎缺血45 min，恢復(fù)灌注24 h 建立小鼠腎缺血再灌注模型［12-13］。與假手術(shù)組比較，手術(shù)組腎功能指標血清Scr 和BUN 水平明顯升高，腎組織病理形態(tài)有明顯的損傷，表明模型制備成功，腎功能明顯受損。與手術(shù)組和溶劑組相比，術(shù)前30 min腹腔注射AS?1處理后，能有效增加腎臟肌酐及尿素氮清除能力，血清肌酐和尿素氮水平明顯降低，腎組織病理形態(tài)損傷有所減輕，表明AS?1對小鼠腎缺血再灌注損傷具有保護作用。

缺血再灌注損傷的病理反應(yīng)與炎癥反應(yīng)密切相關(guān)，炎癥反應(yīng)可以顯著惡化腎缺血再灌注損傷。在缺血缺氧狀態(tài)下，血小板、巨噬細胞、腎小管上皮細胞等細胞活化，釋放大量促炎因子如TNF?α、IL?6、黏附分子及其他趨化因子，在這些細胞因子、趨化因子及黏附分子的相互作用下，導(dǎo)致血管內(nèi)皮細胞活化，血管通透性增加，大量炎性細胞浸潤和聚集于組織間，增加氧自由基生產(chǎn)，造成炎癥反應(yīng)的級聯(lián)放大反應(yīng)，引起腎臟組織的損傷和功能的受損［14-15］。因此，TNF?α、IL?6等含量的升高及炎性細胞浸潤增多可以作為炎癥反應(yīng)的指標。本研究中，小鼠腎缺血再灌注損傷后促炎因子TNF?α、IL?6 的表達明顯增加，CD68+和MPO炎癥細胞浸潤增多，而給予AS?1 處理后，能有效減少促炎因子的釋放并減輕炎癥細胞的浸潤，表明AS?1減輕腎缺血再灌注損傷、改善腎臟功能的作用可能與其抗炎癥反應(yīng)有關(guān)。

細胞凋亡也是腎缺血再灌注損傷的重要發(fā)病機制之一，腎缺血再灌注后可引起氧自由基大量聚集，誘發(fā)腎小管上皮細胞的凋亡，腎細胞的凋亡可導(dǎo)致腎組織的結(jié)構(gòu)萎縮和腎細胞數(shù)目的減少，甚至誘發(fā)腎功能的急劇下降［16］。Caspase 蛋白酶家族在腎缺血再灌注損傷誘導(dǎo)的細胞調(diào)亡中發(fā)揮著重要的作用，被認為是細胞調(diào)亡過程中的關(guān)鍵環(huán)節(jié)和執(zhí)行者，Caspase 3 是Caspase 家族中最主要的效應(yīng)靶點，細胞凋亡發(fā)生時，Cleaved caspase3 的表達明顯增加［17］，本研究中，小鼠腎缺血再灌注損傷后Cleaved caspase3的表達明顯升高，而給予AS?1處理后，能明顯抑制其表達升高的現(xiàn)象。Bcl?2家族在細胞凋亡中也發(fā)揮著重要的決定作用，其是促凋亡和抗凋亡基因家族中的主要成員，包括促凋亡基因如Bax、Bak等和抗凋亡基因如Bcl?2等，細胞凋亡的發(fā)生與Bcl?2和Bax表達的上調(diào)或下調(diào)密切相關(guān)，相關(guān)研究表明，在缺血再灌注損傷過程中存在Bcl?2的表達下調(diào)和Bax的表達上調(diào)、兩者的比值降低，而通過預(yù)處理干預(yù)措施使Bcl?2表達上調(diào)和Bax表達下調(diào)、兩者的比值升高后，能夠減輕缺血再灌注損傷誘導(dǎo)的細胞凋亡［17］。本研究中，小鼠腎缺血再灌注損傷24 h 后，Bcl?2 的表達明顯減少，Bax 的表達明顯增加，兩者的比值降低。而給予AS?1 處理后，能明顯上調(diào)Bcl?2 的表達、下調(diào)Bax，使Bcl?2/Bax 的比值顯著增加，說明AS?1對缺血再灌注誘導(dǎo)的腎損傷保護作用與其抗凋亡相關(guān)。

NF?κB作為一種核轉(zhuǎn)錄因子在腎缺血再灌注損傷的過程中發(fā)揮著關(guān)鍵性作用。NF?κB的活化可引起促炎細胞因子及黏附分子等炎癥介質(zhì)的過量表達，引起一系列炎性級聯(lián)反應(yīng)，結(jié)合相關(guān)受體，也會激活相關(guān)凋亡基因，導(dǎo)致細胞凋亡，加重腎組織的損傷［15，18］。本研究中小鼠腎缺血再灌注損傷后p?p65蛋白表達增加，說明NF?κB被活化，NF?κB信號通路被激活，引發(fā)炎癥級聯(lián)反應(yīng)，而給予AS?1 處理后，與腎缺血再灌注組和溶劑+缺血再灌注損傷組相比，p?p65蛋白表達降低，說明NF?κB 信號通路的活化程度被抑制，表明AS?1 可能通過抑制NF?κB信號通路的活化減輕腎局部炎癥反應(yīng)和凋亡損傷，進而改善腎臟功能。

綜上所述，TIR/BB環(huán)擬似物AS?1預(yù)處理對小鼠缺血再灌注引起的腎功能損傷有保護作用，其機制可能與其抑制NF?κB 信號通路的活化產(chǎn)生抗炎和抗凋亡作用有關(guān)，可為臨床開發(fā)應(yīng)用防治急性腎損傷或急性腎衰竭類藥物提供理論基礎(chǔ)及實驗依據(jù)。