銅伴侶蛋白COX17在胃癌組織中的表達

孫偉等

【摘 要】目的：探討線粒體銅伴侶蛋白COX17在胃癌發(fā)中的表達。方法：利用Real-Time PCR法以及Western blot法檢測胃癌中線粒體銅伴侶蛋白基因COX17基因的表達水平。結(jié)果：COX17的mRNA及蛋白表達水平在胃癌組織中均表現(xiàn)為低表達（15/20，75%），差異具有顯著性（P<0.001）。結(jié)論 銅伴侶蛋白COX17在胃癌中異常表達，可能與胃癌發(fā)生有關(guān)。

【關(guān)鍵詞】COX17；胃癌；表達

【中圖分類號】R735.2 【文獻標識碼】A 【文章編號】

COX17是一種分子量約為8kDa的線粒體銅伴侶蛋白，其蛋白異常表達量與活性氧自由基形成有關(guān)，可能繼發(fā)導(dǎo)致基因變異導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生。因此有必要闡明COX17在胃癌中的表達，初步探討COX17在腫瘤形成中的可能角色。

1 材料與方法

1.1 材料

20例胃腫瘤組織標本來自青海大學(xué)附屬醫(yī)院于2005年5月至10月收治的胃腫瘤患者（男13例），年齡51～87歲。所有標本均由胃癌組織及相距5 cm以上的癌旁正常組織配對組成，標本置液氮，-80℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 方法

1.2.1 實時定量PCR法（Quantity Real-Time PCR）

利用iCycler iQTM Real-Time PCR反應(yīng)系統(tǒng) （Bio-Rad，USA），以cDNA為模板進行實時定量PCR擴增。引物序列：COX17：上游5′- ATT TGG CTG TCT CCG CTC AT-3′，下游5′- TGT GGG CCT CAA TTA GAT GTC-3′，擴增長度197 bp；β-actin：上游5′-TTA GTT GCG TTA CAC CCT TTC- 3′，下游5′-ACC TTC ACC GTT CCA GTT T-3′，擴增長度150 bp。每個樣本設(shè)立3個平行反應(yīng)管，相同樣本間擴增CT值小于0.5，取平均值后用于定量計算及分析。PCR參數(shù)：94 ℃變性5 min；進入循環(huán)后94 ℃變性30 s，51 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，循環(huán)44圈；72 ℃充分延伸5 min。PCR反應(yīng)結(jié)束后從55 ℃到95 ℃按每級0.5 ℃遞增作出溶解曲線。

1.2.3 免疫組織化學(xué)

免疫組織化學(xué)方法：石蠟切片經(jīng)80℃烤片2小時，二甲苯脫蠟30分鐘兩次，梯度酒精100%、95%、90%、85%、80%依次水化5分鐘；切片放入EDTA（PH8.0）抗原修復(fù)高壓抗原修復(fù)150秒，冷卻至室溫后1PBS洗片3次，每次5分鐘，加入3℅過氧化氫溶液10分鐘以消除內(nèi)源性過氧化物酶活性，蒸餾水沖洗，1PBS浸泡5分鐘；5%脫脂奶粉室溫封閉1小時，傾去多余封閉液，滴加抗COX17一抗 （Santa Cruz，USA）， 1：500稀釋，4℃冰箱過夜；1PBS洗片3次，每次5分鐘。滴加二抗，室溫1小時；1PBS洗片3次，每次5分鐘。用新鮮配置的DAB顯色液（Dako， UK）顯色10分鐘，流水充分沖洗。蘇木素復(fù)染10秒，自來水沖洗，1%鹽水酒精去浮色2秒，溫水返蘭。梯度酒精回水，二甲苯透明，中性樹膠封片。

1.2.3 統(tǒng)計學(xué)處理方法

定量PCR結(jié)果利用ΔΔCt法計算目的基因相對表達量，計算癌組織中基因表達相對于癌旁正常組織變化倍數(shù)后取2的對數(shù)，大于0的樣本為高表達，小于0的樣本為低表達。癌與癌旁表達差異用t檢驗及百分比同時進行統(tǒng)計分析。

2 結(jié)果

2.1 胃癌和癌旁正常組織中COX17 mRNA的差異表達

對20對胃癌和癌旁正常組織提取RNA并逆轉(zhuǎn)為cDNA進行Realtime-PCR實驗，根據(jù)統(tǒng)計得到的實驗結(jié)果作圖（圖1）。我們發(fā)現(xiàn)有15對（15/20，75%）胃癌組織中的COX17基因 mRNA 表達水平低于與其配對的癌旁正常組織，胃癌與癌旁正常組織COX17 mRNA表達差異具有顯著性（表1. p<0.001）。

2.2 胃癌和癌旁正常組織中COX17 蛋白的差異表達

20對胃癌和癌旁正常組織石蠟包埋，制作組織切片進行IHC分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)胃癌組織及癌旁組織COX17蛋白的表達水平不一致，有16對（16/20，80%）腫瘤組織的COX17蛋白表達水平低于癌旁正常組織（圖2），癌與癌旁組織COX17 蛋白表達差異具有顯著性（表2. p<0.001）。

3 結(jié)論

在我們的研究中發(fā)現(xiàn)了胃癌組織中COX17表達下降，表明COX17表達下調(diào)與活性氧自由基形成有關(guān)[1-2]。因此，推測COX17可能從兩方面介入胃癌的發(fā)生發(fā)展。一方面，COX17的表達改變可以通過活性氧自由基增加正常細胞突變幾率并為腫瘤細胞提供選擇壓力，利于腫瘤細胞形成。另一方面，COX17基因表達下調(diào)能減少細胞色素C氧化酶的組裝，減少氧氣的消耗，更好地適應(yīng)腫瘤組織中低氧環(huán)境，更有利于腫瘤的生長。因此，COX17表達下調(diào)在胃癌的形成及發(fā)展中可能具有重要的意義。

參考文獻：

[1] Kim BE， Nevitt T， Thiele DJ： Mechanisms for copper acquisition， distribution and regulation.Nat Chem Biol，2008，4：176-85，

[2] Cobine PA， Pierrel F， Winge DR： Copper trafficking to the mitochondrion and assembly of copper metalloenzymes. Biochim Biophys Acta， 2006，1763：759-72.