AnnexinA2和MMP—9在胃癌中的表達(dá)及其相關(guān)性

李菁

【摘 要】目的：分別檢測(cè)膜聯(lián)蛋白A2（Annexin A2）和基質(zhì)金屬蛋白酶-9 （matrix metalloproteinases-9，MMP-9）在胃癌中的表達(dá)及其相關(guān)性，探討二者與胃癌臨床病理參數(shù)之間的相關(guān)性。 方法：采用免疫組化SP方法，研究63例胃癌組織和20例正常胃黏膜組織中Annexin A2 、MMP-9的表達(dá)。結(jié)果：AnnexinA2 和MMP-9在胃癌組織中的陽(yáng)性表達(dá)率為90.5%、93.7%，高于正常胃黏膜組織中的表達(dá)率35%、25%，兩組之間比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。annexinA2、MMP-9在胃癌組織中的陽(yáng)性表達(dá)與腫瘤分化程度、浸潤(rùn)深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及TNM分期具有相關(guān)性（P<0.05），而與患者性別、年齡沒(méi)有相關(guān)性（P>0.05）。胃癌組織中Annexin A2和MMP-9的表達(dá)具有相關(guān)性，切呈正相關(guān)（r=0.263，P <0.05）。結(jié)論：Annexin A2、MMP-9在胃癌中的表達(dá)與胃癌惡性生物學(xué)行為密切相關(guān)，研究二者在胃癌組織中的表達(dá)可為胃癌的診斷和預(yù)后判斷提供新思路。

【關(guān)鍵詞】胃癌；免疫組化；膜聯(lián)蛋白A2；基質(zhì)金屬蛋白酶-9

胃癌是起源于胃上皮的惡性腫瘤，導(dǎo)致其預(yù)后差死亡率高的主要原因是其發(fā)生浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移，給患者治療帶來(lái)了極大的困難，大大降低了患者的生存率。目前研究發(fā)現(xiàn)，膜聯(lián)蛋白A2（Annexin A2）對(duì)腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移過(guò)程的影響主要通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)F.actin細(xì)胞骨架及與細(xì)胞外各種蛋白水解酶相互作用等實(shí)現(xiàn)的。MMP-9是基質(zhì)金屬蛋白酶家族（matrix metalloproteinases，MMPs）成員之一，能夠降解細(xì)胞外基質(zhì)，腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移過(guò)程中起著重要的作用。本文對(duì)Annexin A2和MMP-9在胃癌組織中的表達(dá)進(jìn)行研究，并分析二者在胃癌組織中表達(dá)是否具有相關(guān)性。

1 材料與方法

1.1 研究對(duì)象 收集延安大學(xué)附屬醫(yī)院病理科2011年至2012年63胃癌術(shù)后蠟塊標(biāo)本，從中選取20例癌旁正常組織（距胃癌組織大于5cm）。全部病例均經(jīng)手術(shù)和常規(guī)病理證實(shí)，術(shù)前未行任何化療、放療。其中男性49例，女性14例，年齡34歲到81歲，平均年齡60.6歲。病理類(lèi)型： 高中分化腺癌30例，低分化腺癌33例；無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者26例，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者37例；TNM分期Ⅰ期及Ⅱ期共30例，Ⅲ期及Ⅳ期共33例；每個(gè)病理資料完整，每個(gè)病理蠟塊取切片4-6張，分別作預(yù)實(shí)驗(yàn)及免疫組化染色之用，制成連續(xù)切片，便于實(shí)驗(yàn)過(guò)程中作對(duì)比。

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑 兔抗人annexinA2單克隆抗體、兔抗人MMP-9單克隆抗體均為即用型，均購(gòu)自北京博奧森生物技術(shù)有限公司。

1.3 免疫組化染色及結(jié)果判斷 免疫組化采用SP法，每個(gè)病例切片分為二部分，分別檢測(cè)annexinA2 和MMP-9蛋白在胃癌組織中的表達(dá)。annexinA2 和MMP-9

陽(yáng)性染色均位于細(xì)胞漿和（或）細(xì)胞膜上，呈棕黃色，顯色強(qiáng)時(shí)為棕褐色。在光鏡下用高倍鏡視野對(duì)每例組織切片癌組織區(qū)域連續(xù)計(jì)數(shù)500個(gè)細(xì)胞，計(jì)算癌細(xì)胞所占的陽(yáng)性比例。組織中胞漿為黃色或棕黃色為陽(yáng)性，將陽(yáng)性細(xì)胞染色數(shù)量分3級(jí)：弱陽(yáng)性，陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)< 10 % ，顯色強(qiáng)度淡黃色（1分）；強(qiáng)陽(yáng)性，陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)> 65 % ，細(xì)胞呈黃色或棕黃色（3分）；中等陽(yáng)性，陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)及顯色強(qiáng)度界于弱陽(yáng)性和強(qiáng)陽(yáng)性之間（2分）；無(wú)陽(yáng)性，陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)無(wú)（0分）。陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)得分與染色強(qiáng)度得分相加，≥5分為陽(yáng)性（+），<3 分為陰性（-）。顯色強(qiáng)度與背景色無(wú)差異者為陰性。結(jié)果由3個(gè)以上病理研究者進(jìn)行閱片，結(jié)果不統(tǒng)一者，進(jìn)行重新閱片，以多數(shù)觀察者的結(jié)果為標(biāo)準(zhǔn)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

應(yīng)用SPSS 1 7.0軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，annexinA2 和MMP-9與胃癌各臨床病理相關(guān)因素之間的差異性比較采用X2檢驗(yàn)，Spearman等級(jí)相關(guān)分析用于各指標(biāo)間相關(guān)性研究。α=0.05為檢驗(yàn)水準(zhǔn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P<0.01為差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 annexinA2、MMP-9在胃癌和正常胃粘膜組織中的表達(dá)

胃癌組織中的annexinA2、MMP-9陽(yáng)性表達(dá)率分別為90.5%（57/63）和93.7%（59/63），正常胃黏膜annexinA2、MMP-9陽(yáng)性表達(dá)率分別為35.0%（7/20）和25.0%（5/20），經(jīng)X2檢驗(yàn)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。

2.2 annexinA2、MMP-9表達(dá)與胃癌組織臨床病理特征關(guān)系

經(jīng)X2檢驗(yàn)：annexinA2、MMP-9在胃癌組織中的表達(dá)與腫瘤分化程度、浸潤(rùn)深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及TNM分期具有相關(guān)性（P<0.05），而二者與患者性別、年齡均無(wú)相關(guān)性（P>0.05）。

2.3胃癌組織中annexinA2表達(dá)與MMP-9表達(dá)的相關(guān)性

胃癌組織中57例annexinA2表達(dá)陽(yáng)性者，其MMP-9表達(dá)陽(yáng)性53例，表達(dá)陰性4例；6例annexinA2表達(dá)陰性者，其MMP-9表達(dá)陽(yáng)性4例，表達(dá)陰性2例。經(jīng)Spearman等級(jí)相關(guān)分析，annexinA2和MMP-9在胃癌組織表達(dá)具有相關(guān)性，切呈正相關(guān)性（r=0.263 ，P<0.05）。

3 討論

惡性腫瘤的主要生物學(xué)特性是浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移這也是惡性腫瘤患者的主要死因。人們對(duì)腫瘤浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移的機(jī)制進(jìn)行了廣泛的研究，并發(fā)現(xiàn)細(xì)胞外基質(zhì)在腫瘤的浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移過(guò)程中起著重要的作用。細(xì)胞外基質(zhì)是由細(xì)胞分泌到細(xì)胞外間充質(zhì)中的蛋白質(zhì)和多糖類(lèi)大分子物質(zhì)，構(gòu)成復(fù)雜的網(wǎng)架，連接組織結(jié)構(gòu)、調(diào)節(jié)組織的發(fā)育和細(xì)胞生理活動(dòng)，是阻礙腫瘤浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移的天然屏障，腫瘤浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移初期，腫瘤細(xì)胞能夠分解細(xì)胞外基質(zhì)從中通過(guò)。細(xì)胞外基質(zhì)包括膠原蛋白、層粘連蛋白、彈性蛋白、TN-C及其他多種蛋白比如基質(zhì)金屬蛋白酶及其抑制劑等，有研究表明AnnexinA2是TN-C的受體，它們和基質(zhì)金屬蛋白酶共同作用于細(xì)胞間質(zhì)，促進(jìn)腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移。

膜聯(lián)蛋白（Annexin，ANX）是一個(gè)Ca2+依賴(lài)的磷脂結(jié)合蛋白家族，物種間膜聯(lián)蛋白高度保守，脊椎動(dòng)物細(xì)胞中膜聯(lián)蛋白被定義為膜聯(lián)蛋白A家族，其家族在人類(lèi)存在12個(gè)成員，主要有A1--A11和A13，而膜聯(lián)蛋白A2又稱(chēng)膜聯(lián)蛋白Ⅱ、ANXⅡ、LPc2P36、LipoeortinⅠ和CalpactionⅠ重鏈[1-2]。AnnexinA2可分布于細(xì)胞的胞核、胞漿及細(xì)胞的表面，胞外的AnnexinA2是組織型纖溶酶原激活物、纖溶酶原及細(xì)胞黏合素C的受體，這些蛋白酶及其底物均與腫瘤的發(fā)展及轉(zhuǎn)移關(guān)系密切。研究證實(shí)在腫瘤細(xì)胞表面已有組織蛋白酶B與AnnexinA2四聚體相互作用，由此推測(cè)：通過(guò)AnnexinA2使以上多種蛋白酶及其底物在腫瘤細(xì)胞表面共區(qū)域化，可能促進(jìn)：激活蛋白酶前體啟動(dòng)蛋白水解級(jí)聯(lián)反應(yīng)；選擇性降解細(xì)胞外基質(zhì)蛋白，從而導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞從原發(fā)腫瘤灶脫離并遷移、侵犯局部組織。AnnexinA2是纖溶酶原和組織性纖維蛋白酶原激活劑（tPA）的受體，可以促進(jìn)纖溶酶的產(chǎn)生并激活其蛋白水解功能，產(chǎn)生纖溶酶，而已知過(guò)量的纖溶酶能降解血管壁細(xì)胞外基質(zhì)和基底膜。在腫瘤血管生成和浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移中也有重要作用。因此，AnnexinA2作為蛋白酶和細(xì)胞外基質(zhì)蛋白的受體能夠激活蛋白酶并啟動(dòng)蛋白水解級(jí)聯(lián)反應(yīng)，選擇降解細(xì)胞外基質(zhì)蛋白和基底膜，從而導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞的粘附、浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移[3-4]。

MM -9是基質(zhì)金屬蛋白酶家族（matrix metalloproteinases，MMPs）成員之一，也是MMPs中分子量最大的酶，與MMPs的其他成員一樣，其也是具有鋅脂結(jié)構(gòu)的鈣依賴(lài)性蛋白水解酶，能夠降解細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）中的Ⅳ型膠原、Ⅴ型膠原和明膠，在上皮或內(nèi)皮細(xì)胞的基底膜部，ECM以基底膜的形式存在，因此，MM-9能夠通過(guò)破壞基底膜的完整性，在腫瘤的發(fā)生發(fā)展和侵襲轉(zhuǎn)移中起著重要的作用。研究發(fā)現(xiàn)，MM -9具有調(diào)節(jié)細(xì)胞粘附力的功能，幫助癌細(xì)胞完成對(duì)ECM的粘附、脫離和遷移[5]。腫瘤的發(fā)生發(fā)展有賴(lài)于腫瘤新生血管的生成，MM -9通過(guò)降解基底膜和細(xì)胞外基質(zhì)有促進(jìn)血管內(nèi)皮遷移和血管塑形，促進(jìn)腫瘤新生血管的生成[6]。也有人認(rèn)為MM -9參與腫瘤血管的生成可能是通過(guò)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）改變內(nèi)皮細(xì)胞的活化形式，增強(qiáng)MMP-9的釋放，加快基底膜的降解和內(nèi)皮細(xì)胞的遷移來(lái)促進(jìn)腫瘤血管的生成[7]。近年來(lái)，國(guó)內(nèi)外學(xué)者在許多腫瘤組織中都發(fā)現(xiàn)MMP-9高表達(dá)，并發(fā)現(xiàn)其表達(dá)程度與腫瘤的侵襲性有關(guān)[8-11]。

本實(shí)驗(yàn)采用免疫組化SP方法檢測(cè)63例胃癌組織和20例正常胃黏膜組織中AnnexinA2 和MMP-9的表達(dá)。結(jié)果顯示，AnnexinA2 和MMP-9在胃癌組織中的陽(yáng)性表達(dá)率為90.5%、93.7%，高于正常胃黏膜組織中的表達(dá)率35%、25%，兩組之間比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。annexinA2在胃癌組織中的陽(yáng)性表達(dá)與腫瘤分化程度、浸潤(rùn)深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及TNM分期具有相關(guān)性（P<0.05），王勇[12]等研究發(fā)現(xiàn)，AnnexinA2不但在胃癌中呈高表達(dá)，且與胃癌分期、浸潤(rùn)深度等病理學(xué)特征也有良好的相關(guān)性，越是晚期胃癌，表達(dá)越高，這與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果一直。MMP-9的表達(dá)與胃癌臨床病理參數(shù)之間的關(guān)系，結(jié)果顯示，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組明顯高于未發(fā)生淋巴轉(zhuǎn)移組（P<0.01），這與Kabashima[13]等研究結(jié)論相同。同時(shí)發(fā)現(xiàn)MMP-9在胃癌中的表達(dá)與其分化程度、浸潤(rùn)深度及TNM分期密切相關(guān)（P<0.05），由此推測(cè)，MMP-9在胃癌的浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移過(guò)程中有著重要的意義。結(jié)果顯示，二者在胃癌中的表達(dá)與腫瘤的浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移具有相關(guān)性。這提示聯(lián)合檢測(cè)二者在胃癌中的表達(dá)，可能為胃癌的診斷及預(yù)后提供新的依據(jù)，但具體機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。

參考文獻(xiàn)：

[1] Hoshida Y，T.Toffanin S，Lachenmayer A， et al.Molecular classification and novel targets in hepatocellularn carcinoma：recent advancement[J].Semin Liver Dis，2010，30（1）：35-51.

[2] Stefaniuk P，Cianciara J，Wiercinska-Drapalo A.Present and future possbilities for early diagnosis of hepatocellular[J].Woeld J Gastroenterol，2010，16（4）：418-424.

[3] Liu Q，Duan ZP，Ha DK，et al.Synbiotic modulation of gut flora：effect on minimal hepactic encephalopathy in patirents with liver cirrhosis[J].Hepatology，2004，39（5）：1441-1449.

[4] Rayes N，Seehofer D，Neuhaus P，Prebitoics，synbiotics in surgery—are they only trendy，truly effective or even dangerous？ [J].Langenbecks Arch Surg，2009，394（3）：547-555.

[5] Yamada K，，Endogenous modulator for drug dependence [J].Biol Pharm Bull，2008，31（9）：1635-1638.

[6] Zacker S，Mirza H，Conner CE，et a1.Vascular endothelial growth factor induces tissue factor and matrix metalloproteinase production in endothelial cells：conversion of prothrombin to thrombin results in progelatinase A activation and cell proliferation[J].Int J Cancer，1998，75（5）：780.

[7] Hofmann UB，WestphaI JR，Vanmuijen GN，et al . Matrix metaIIoproteinases in human meIanoma[J]. J Invest DermatoI，2000，115（3）：337 - 344 .

[8] Hdnuum UB，Westphal JR，Van KrtmtsA A，et a1.Expression of integrin alpha（v）beta（3）correlates with activation of membarypematrix metalloproteinase-1（MTI·MMP）and matrix metallopmteinase-2（MMP-2）in human melanoma cells invitro and in vivo[J].Int J Cancer，2000，87（1）：12-19

[9] Nemeth J A，Yousif R，Herzog M，et a1.Marxmetalloproteinase activity，bone marxturnover.and tumor cell proliferation in pros tatecancer bone metastasis[J].J Natl Cancer lnst，2002，94（1）：17-25

[10] Koyama H，1 wata H，Kuwabara Y，et a1.Gelatlnolytie activity of matrixmetalIoproteinase-2 and-9 in oesophageai carcinoma in study using in situ zymogaphy[J].Eur J Cancer，2000，36（1 6）：2l64-2170.

[11] Bodey B，Bodey BJ，Siegel SE，et a1.Immunocytochemicai detection of matrix metalloproteinase expression in prostate Cancer[J].InVivo，200l，15（I）：65-70.

[12] 王勇，丁俊，杜林.AnnexinA2在胃癌組織中的表達(dá)及其臨床病理的關(guān)系[J].山東醫(yī)藥，2004，44：19-20.

[13] Kabashima A，Machara Y，Kakeji Y，et a1.Clineopatholofical features and over expression of matrix metallopmteinases in intramucoral gastric carci-noma with Lymph node metastasis[J].Clin Cancer Res，2000，6（9）：3581—3584.