大孔吸附樹脂純化銀杏黃酮的工藝研究

程再功　顧雪梅　胡進(jìn)維　李銀

【摘 要】目的：研究大孔吸附樹脂純化銀杏總黃酮的工藝條件及參數(shù)。方法：采用靜態(tài)吸附、解吸，從6種大孔樹脂中篩選用于銀杏總黃酮分離的最佳樹脂，并通過動(dòng)態(tài)行為系統(tǒng)考察最佳大孔樹脂的吸附性能和最優(yōu)洗脫參數(shù)。結(jié)果：HPD-450型大孔樹脂為分離銀杏黃酮的最佳樹脂，其分離的最佳工藝為，上樣量為6.5倍柱體積藥液，以5mL/min的流速，pH值為4.0上柱，用400mL85%乙醇以4mL/min流速進(jìn)行洗脫，結(jié)論：按照最佳工藝可獲得總黃酮純度達(dá)26%以上的銀杏葉提取物。

【關(guān)鍵詞】銀杏葉提取物；大孔吸附樹脂；黃酮；正交試驗(yàn)

銀杏樹是中國(guó)古老的樹種之一，占世界總量的70%，其葉片是一種具有很高藥用價(jià)值的植物，含有黃酮、萜類內(nèi)酯等多種有效成分，對(duì)于心腦血管、腫瘤、衰老等疾病的治療和預(yù)防具有重要意義，并具有廣闊的市場(chǎng)前景[1]。

銀杏葉中含量最高的是黃酮類物質(zhì)。銀杏葉黃酮的主要提取分離方法有：溶劑法、樹脂法、超臨界萃取法、毛細(xì)管電泳法、高效液相色譜法、酶法、細(xì)胞和組織培養(yǎng)法等[2-4]。其中樹脂法為目前廣泛使用的方法，本文旨在研究不同型號(hào)大孔樹脂對(duì)銀杏黃酮的吸附行為，確定最佳吸附樹脂并優(yōu)化其工藝參數(shù)，以指導(dǎo)大生產(chǎn)，提供重要參考數(shù)據(jù)。

1 試驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

Agilent1200型高效液相色譜儀、梅特勒XS205電子天平、梅特勒S20KPH計(jì)、IKA公司RV-10旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀；甲醇（色譜級(jí)）、鹽酸、氫氧化鈉、亞硝酸鈉均為分析純；槲皮素對(duì)照品（批號(hào)：100081-200907）、山柰素對(duì)照品（110861-201209）、異鼠李素對(duì)照品（批號(hào)：110860-201109）均購自中檢所；銀杏葉（商丘嘉信醫(yī)藥商貿(mào)有限公司）。

1.2 大孔樹脂的預(yù)處理

稱取樹脂適量，以95%乙醇浸泡24h，使其充分溶脹。采用濕法裝柱，以95 %乙醇沖洗至流出液與水混合（1∶5）不再產(chǎn)生白色渾濁時(shí)，用蒸餾水洗至無醇味，然后用1mol/L HCl以4BV/h的流速?zèng)_洗0.5h，即2BV，浸泡4h后，用蒸餾水洗至中性，再用1mol/LNaOH以4BV/h的流速?zèng)_洗0.5h，浸泡4h后，用蒸餾水洗至中性，備用。

1.3銀杏葉浸出液的制備

取銀杏葉藥材，切制（2-4cm）處理，精密稱取100g，加1000mL60%乙醇于65℃水浴鍋中提取2h，過濾，減壓濃縮至約100 mL，加入800mL水，并不斷攪拌混勻，靜置12h，取上清液備用。

1.4 銀杏黃酮含量測(cè)定

1.4.1色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；以甲醇-0.4%磷酸溶液（50：50）為流動(dòng)相；檢測(cè)波長(zhǎng)360nm，流速1.0mLl/min，柱溫35℃。理論塔板數(shù)按槲皮素峰計(jì)算應(yīng)不低于2500。

1.4.2線性關(guān)系考察

分別精密稱取槲皮素對(duì)照品30mg，山奈素對(duì)照品30mg，異鼠李素對(duì)照品20mg置100ml量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻。再從中精密量取2mL、4mL、8mL、10mL、15mL分別置于100mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，分別吸取上述對(duì)照品溶液10μL，注入液相色譜儀，計(jì)算峰面積。以對(duì)照品濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，線性回歸得標(biāo)準(zhǔn)曲線方程。其線性范圍和相關(guān)系數(shù)為：槲皮素：5.92-44.43μg/mL，r=0.9999；山奈素：5.98-44.91μg/mL，r=0.9999；異鼠李素：4.00-30.06μg/mL，r=0.9999?？傸S酮苷的計(jì)算方法按《中國(guó)藥典》（2010年版）一部[5]的方法計(jì)算，即將3種苷元之和乘以系數(shù)2.51。

2 結(jié)果與討論

2.1 靜態(tài)吸附試驗(yàn)（大孔樹脂篩選）

準(zhǔn)確稱取已處理好的大孔樹脂2.00g，置于具塞的磨口錐形瓶中，加入銀杏葉水沉上清液（0.993mg/mL）100mL，室溫振蕩24h，測(cè)定吸附前后黃酮濃度的變化，按下式計(jì)算樹脂的靜態(tài)吸附量和吸附率。將吸附飽和的大孔樹脂用水洗至洗脫液無色，濾紙吸干樹脂表面殘留的溶液，加入150mL85%乙醇，振蕩24h，過濾，測(cè)定洗脫液中總黃酮濃度，按下式計(jì)算樹脂解吸率。

吸附率=（C0×V0-C1×V1）/C0×V0×100%

樹脂吸附量=（C0×V0-C1×V1）/M

解吸率=C2×V2/（C0×V0-C1×V1）×100%。

式中：C0為吸附前溶液中黃酮初始濃度，mg/mL；C1為吸附后溶液中黃酮剩余濃度，mg/mL；C2為解吸液中黃酮濃度，mg/mL；V0為吸附時(shí)黃酮粗提液加入體積，mL；V1為吸附殘液體積，mL；V2為解吸液體積，mL；M為樹脂用量，g。

從表1可知：HPD-417、ADS-17吸附量不高，HPD-750、DM130吸附率較大，但解吸率相對(duì)較低，而D140與HPD-450相比，具有接近的吸附量和吸附率，但解吸率不如HPD-450。綜合考慮分析，HPD-450為最佳樹脂，因此選擇它作為后續(xù)試驗(yàn)的樹脂材料。

2.2 動(dòng)態(tài)行為考察

大孔樹脂對(duì)銀杏葉提取液中黃酮類成分的分離純化受很多因素的影響，如上樣液的酸堿度、上樣量、吸附速度、洗脫速度、洗脫溶液的濃度和用量等，必須進(jìn)行合理的考察，以確定能使銀杏葉中黃酮類成分得到最佳的分離條件。

2.2.1 上樣量的確定

取銀杏葉水沉上清液（總黃酮濃度為0.993mg/mL，pH=4），以5mL/min的流速上樹脂柱（柱體積150mL）。分別在0.5、1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、5.5、6、6.5、7、7.5、8h時(shí)，測(cè)流出液的黃酮濃度，以時(shí)間為橫坐標(biāo)，未吸附率（未吸附率=流出液中成分含量/上柱前樣品溶液成分含量×100%）為縱坐標(biāo)繪制銀杏總黃酮泄漏曲線，見下圖：

由圖1可知：在4h處，即上樣量在7倍柱體積時(shí)開始明顯泄露，說明樹脂吸附達(dá)到飽和。為了使總黃酮保留完全，設(shè)定吸附率10%為泄露點(diǎn)，即上樣量最終確定為6.5倍柱體積。

2.2.2 吸附上樣液PH值的確定

由圖2可知pH值4.0（原液pH值時(shí)）樹脂對(duì)黃酮的吸附率最高，這是由于酸性化合物在酸性條件下的吸附作用較強(qiáng)，堿性化合物在堿性條件下吸附作用較強(qiáng)。黃酮類化合物由于多含有酚羥基而顯酸性，因而要達(dá)到較好的吸附效果，必須在弱酸或酸性條件下吸附，本試驗(yàn)中黃酮上柱液原液pH值即為4.0，故上柱前不需要調(diào)整。

2.2.3 HPD-450吸附洗脫影響因素考察

實(shí)驗(yàn)選擇影響樹脂吸附洗脫的重要因素——吸附流速、洗脫流速、乙醇濃度和乙醇使用量4個(gè)因素，分別在每個(gè)因素下選取3個(gè)水平進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn)，并制得因素水平表、工藝參數(shù)優(yōu)選正交試驗(yàn)表和方差分析表。

分析：根據(jù)吸附工序工藝優(yōu)選正交試驗(yàn)表結(jié)果直觀分析，R值C>D>A>B，因素主次關(guān)系為乙醇濃度>乙醇用量>吸附流速>洗脫流速，方差分析表結(jié)果表明，因素C具有顯著影響（P<0.05）。得出最佳工藝參數(shù)為A2B1C3D3，即吸附速度：5mL/min、洗脫速度：4mL/min、乙醇濃度85%、乙醇用量600mL。

2.2.4 應(yīng)用

根據(jù)以上確定的吸附工序工藝參數(shù)，對(duì)應(yīng)大生產(chǎn)所用的樹脂量進(jìn)行換算，得到大生產(chǎn)工藝參數(shù)（柱體積為300L），即上樣量：1950L藥液（黃酮濃度為0.993mg/mL），吸附速度：600L/h、洗脫速度：480L/h、乙醇濃度85%，乙醇用量800L，我們進(jìn)行了6批放大生產(chǎn)，結(jié)果如下：

從表5可以看出，工藝參數(shù)經(jīng)過優(yōu)化后，銀杏黃酮的含量有了顯著的提高，平均含量已經(jīng)在26%以上（原工藝平均含量為24.7%），說明優(yōu)化后的工藝參數(shù)較合理，符合大生產(chǎn)的要求。

3 討論

所選的6種大孔樹脂中，HPD-450大孔樹脂為吸附銀杏黃酮的理想樹脂，吸附量大，飽和吸附量達(dá)到28.3mg/g，易洗脫，解析率達(dá)91%，分離效果好，且純度高，但吸附速度如果過快，泄露較早。

《中國(guó)藥典》（2010年版）一部中規(guī)定銀杏葉提取物中黃酮醇苷的含量不低于24.0%，本文通過試驗(yàn)室小試，優(yōu)選出理想的大孔樹脂并改進(jìn)工藝參數(shù)，并通過車間放大生產(chǎn)，驗(yàn)證了其工藝參數(shù)的合理性。將銀杏黃酮的含量由原先的24.7%提高到26%，為今后生產(chǎn)出高品質(zhì)銀杏葉提取物奠定了基礎(chǔ)。

參考文獻(xiàn)：

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[5] 中國(guó)藥典[S].一部.2010.