免疫熒光法檢測(cè)APPSWE轉(zhuǎn)基因小鼠海馬內(nèi)NF—κB的表達(dá)

何寧　張莉蓉

【摘 要】目的：了解阿爾茨海默病轉(zhuǎn)基因小鼠海馬內(nèi)NF-κB的激活情況。方法：選用12月齡的阿爾茨海默病轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性小鼠為模型，同窩生野生型小鼠為對(duì)照，免疫熒光法檢測(cè)其海馬內(nèi)NF-κB的表達(dá)。結(jié)果：與對(duì)照鼠相比，AD轉(zhuǎn)基因模型小鼠海馬細(xì)胞內(nèi)NF-κB的表達(dá)增多。結(jié)論： NF-κB在阿爾茨海默病的發(fā)病中可能起重要作用。

【關(guān)鍵詞】阿爾茨海默??；轉(zhuǎn)基因小鼠；海馬；免疫熒光

阿爾茨海默病（Alzheimers Disease，AD）是一種進(jìn)行性中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病，其主要臨床表現(xiàn)為記憶減退、認(rèn)知障礙等，發(fā)病機(jī)制尚不完全明確[1]。

核因子κB（NF-κB）是一種具有多向轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)作用的蛋白質(zhì)，與神經(jīng)細(xì)胞的生長(zhǎng)、發(fā)育、塑型有關(guān)，在多種急、慢性神經(jīng)退行性變中發(fā)揮作用，本文擬通過(guò)研究阿爾茨海默病小鼠模型海馬中NF-κB水平的變化，了解其在阿爾茨海默病發(fā)生發(fā)展中的作用。

1 材料、儀器

1.1實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1主要試劑

兔抗鼠NF-κB多克隆抗體（Santa Cruza公司），Tap酶（Promega公司），蛋白酶K、dNTP（大連寶生物工程有限公司），Tris（上?；瘜W(xué)試劑總廠有機(jī)化工廠），PCR引物 （北京百泰克生物技術(shù)有限公司合成）。

1.2主要儀器

熒光顯微鏡（BX61， Olympus），擴(kuò)增儀Gene AMP 2400，TA-2R臺(tái)式冷凍離心機(jī)（上海市離心機(jī)械研究所），DYY-Ⅲ-5型穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀（北京市六一儀器廠），WD-9403F紫外儀（北京市六一儀器廠）。

1.3實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

動(dòng)物、動(dòng)物鑒定及分組：APPSWE轉(zhuǎn)基因模型鼠（Tg2576，美國(guó)Taconic Company），購(gòu)于南京大學(xué)模式動(dòng)物研究所，隨機(jī)選取同窩生的APPSWE陽(yáng)性小鼠和陰性鼠進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 DNA提取

小鼠出生后10d，剪尾巴0.5cm，置1.5ml EP管，加緩沖液（500?l 消化液+5?l 蛋白酶K）500?l，55℃的水浴中消化過(guò)夜；消化好的組織搖勻，每管加入500?l酚/氯仿（體積比1：1），混勻、離心（12000rpm，10min）；轉(zhuǎn)移上清液400?l至新的1.5ml EP管內(nèi)，加800?l無(wú)水乙醇混勻，離心（12000rpm，5min）后棄去上清，加入800?l70%乙醇，離心（12000rpm，5min），棄去上清后晾干；加入200?lTE，放入37℃水浴1小時(shí)助溶后低溫保存。

2.2 PCR反應(yīng)

提取的DNA置PCR儀擴(kuò)增。上游引物為5 CTG ACC ACT CGACCA GGTTCT GGG T 3，下游引物為5 GTG GAT AAC CCC TCC CCC AGG CTA GAC CA 3。PCR產(chǎn)物為466bp，反應(yīng)條件：94℃變性45s，55℃退火1min，72℃延伸1min，共25個(gè)循環(huán)。

2.3瓊脂糖電泳 1.0%瓊脂糖凝膠電泳觀察PCR結(jié)果。

3 免疫熒光染色

取固定好的小腦組織，切50?m冠狀片，放入24孔板內(nèi)，PB液沖洗3次，滴加兔抗鼠NF-κBp50多克隆一抗孵育過(guò)夜；取出24孔板放置30分鐘，回收一抗，PB液沖洗3次，滴加Alexa568二抗，避光室溫孵育3小時(shí)，回收二抗，PB液沖洗四次；將切片撈到玻片上，65%甘油封片，熒光顯微鏡下觀察NF-κB表達(dá)。

4 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

通過(guò)NF-κB的激活圖片可知，轉(zhuǎn)基因模型小鼠的海馬內(nèi)NF-κB的表達(dá)多于對(duì)照小鼠。

5 討論

NF-κB是一個(gè)多功能核轉(zhuǎn)錄因子，最先在B淋巴細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)，其能與免疫球蛋白k輕鏈基因κB特異結(jié)合，故稱之為核因子-κB。NF-κB激活后參與許多基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控，在感染、炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激、細(xì)胞增生、細(xì)胞凋亡等過(guò)程中發(fā)揮作用。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示阿爾茨海默病轉(zhuǎn)基因小鼠海馬內(nèi)的表達(dá)增高，提示NF-κB的異常表達(dá)在阿爾茨海默病的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用。應(yīng)該注意到，NF-κB的激活可能誘導(dǎo)抗凋亡基因，也可能誘導(dǎo)促凋亡基因，結(jié)果依賴于刺激信號(hào)的類型和細(xì)胞差異[2]。已知的研究[3-6]表明可能存在以下兩種途徑的細(xì)胞凋亡：（1）NF-κB誘導(dǎo)抗凋亡因子；（2）通過(guò)蛋白間相互作用而干預(yù)凋亡信號(hào)通路。

本實(shí)驗(yàn)無(wú)法了解NF-κB是促進(jìn)凋亡還是抑制凋亡，因此仍需進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)分析不同日齡的阿爾茨海默病轉(zhuǎn)基因小鼠與同窩野生型小鼠腦組織NF-κB激活情況，結(jié)合不同日齡轉(zhuǎn)基因小鼠與同窩生野生型小鼠腦組織細(xì)胞凋亡情況，才可以了解NF-κB是促進(jìn)凋亡還是抑制凋亡，為阿爾茨海默病的發(fā)病機(jī)制和臨床治療提供更充分的理論依據(jù)。

參考文獻(xiàn)：

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