殼聚糖對(duì)克氏原螯蝦抗低溫應(yīng)激的影響

毛文敏 劉晴等

摘要：采用單因子試驗(yàn)設(shè)計(jì)方法，以克氏原螯蝦（Procambarus clarkii）為研究對(duì)象，將試驗(yàn)分成陰性對(duì)照組、陽(yáng)性對(duì)照組和3個(gè)試驗(yàn)組共5組，陰性對(duì)照組投喂基礎(chǔ)飼料，飼養(yǎng)試驗(yàn)結(jié)束后不進(jìn)行低溫應(yīng)激處理；陽(yáng)性對(duì)照組投喂基礎(chǔ)飼料，飼養(yǎng)試驗(yàn)結(jié)束后與試驗(yàn)組一起進(jìn)行低溫應(yīng)激處理；3個(gè)試驗(yàn)組分別投喂在基礎(chǔ)飼料中添加0.50%、1.00%、1.50%殼聚糖的試驗(yàn)飼料，室溫下飼養(yǎng)2個(gè)月后測(cè)定克氏原螯蝦血清中的葡萄糖含量、過(guò)氧化氫酶（CAT）和堿性磷酸酶（AKP）活力，旨在探討殼聚糖對(duì)克氏原螯蝦抗低溫應(yīng)激的影響。結(jié)果表明，與陽(yáng)性對(duì)照組相比，飼料中添加適量的殼聚糖均能降低處于低溫應(yīng)激下克氏原螯蝦體內(nèi)的血糖含量，提高血清中CAT和AKP活力，其中1.00%殼聚糖組血糖含量降低的幅度最大，0.50%殼聚糖組和1.00%殼聚糖組血清中CAT活力提高的幅度最大；0.50%殼聚糖組血清中AKP活力提高的幅度最大；但均未達(dá)到無(wú)應(yīng)激水平。由此看來(lái)，在克氏原螯蝦飼料中添加0.50%～1.00%的殼聚糖可以在一定程度上起到抵抗低溫應(yīng)激的作用。

關(guān)鍵詞：克氏原螯蝦（Procambarus clarkii）；殼聚糖；抗應(yīng)激；低溫

中圖分類(lèi)號(hào)：S963.73 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：0439-8114（2013）09-2111-03

水產(chǎn)動(dòng)物在集約化養(yǎng)殖業(yè)中面臨著越來(lái)越多的應(yīng)激因素的影響，如水質(zhì)污染、冷熱、驚嚇、運(yùn)輸、營(yíng)養(yǎng)不良、有害物質(zhì)侵襲、飼養(yǎng)管理不當(dāng)?shù)龋@些不同種類(lèi)及不同程度的應(yīng)激可直接影響水產(chǎn)動(dòng)物正常的生長(zhǎng)發(fā)育，嚴(yán)重時(shí)可導(dǎo)致機(jī)體免疫力下降，誘發(fā)疾病甚至死亡。因此，減少或消除水產(chǎn)動(dòng)物的應(yīng)激因素是養(yǎng)殖者不可忽視的重要問(wèn)題。有關(guān)研究表明，要減少和消除應(yīng)激因素，除了實(shí)行科學(xué)飼養(yǎng)管理外，還可以根據(jù)具體情況在飼料中添加一些抗應(yīng)激添加劑[1，2]。

有些生物活性物質(zhì)既可增強(qiáng)魚(yú)類(lèi)的抗應(yīng)激能力，又可增強(qiáng)免疫功能。因此，開(kāi)發(fā)抗應(yīng)激免疫增強(qiáng)劑能提高魚(yú)類(lèi)生產(chǎn)性能和降低其發(fā)病率，具有廣闊的應(yīng)用前景。殼聚糖作為免疫增強(qiáng)劑能提高水產(chǎn)動(dòng)物免疫功能的研究和報(bào)道已不少[3，4]，本研究用含有殼聚糖的飼料飼喂克氏原螯蝦（Procambarus clarkii），通過(guò)測(cè)定低溫處理后克氏原螯蝦血清中葡萄糖（G）含量及堿性磷酸酶（AKP）和過(guò)氧化氫酶（CAT）活力，探討殼聚糖對(duì)克氏原螯蝦抗低溫應(yīng)激的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

克氏原螯蝦、試驗(yàn)飼料原料購(gòu)自南京市水產(chǎn)科學(xué)研究所養(yǎng)殖試驗(yàn)場(chǎng)。挑選健壯活潑、無(wú)病無(wú)傷的克氏原螯蝦，平均體重（22.05±2.15） g。殼聚糖為低聚殼聚糖，由上海海洋大學(xué)食品學(xué)院提供，殼聚糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)為100%。葡萄糖、AKP和CAT試劑盒購(gòu)自南京建成生物工程研究所。

1.2 方法

1.2.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)及飼料制備 試驗(yàn)用基礎(chǔ)飼料配方（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）為：魚(yú)粉5.00%、豆餅35.00%、菜餅5.00%、棉餅5.00%、次粉35.00%、麥麩5.00%、皮糠5.00%、磷酸氫鈣1.50%，沸石粉2.00%、食鹽0.50%、預(yù)混料1.00%。3種試驗(yàn)飼料為在基礎(chǔ)飼料中分別添加質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.50%、1.00%、1.50%的殼聚糖，相應(yīng)減少次粉的質(zhì)量分?jǐn)?shù)。將各種原料分別粉碎后過(guò)40目篩，按配比精確稱量、采用逐級(jí)放大法使微量原料充分混勻，加適量水、用小型絞肉機(jī)加工成直徑為1.5 mm的顆粒飼料，60 ℃恒溫干燥后置-20 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

將試驗(yàn)分成陰性對(duì)照組、陽(yáng)性對(duì)照組和3個(gè)試驗(yàn)組共5組，每組3個(gè)重復(fù)。陰性對(duì)照組投喂基礎(chǔ)飼料，飼養(yǎng)試驗(yàn)結(jié)束后不進(jìn)行低溫應(yīng)激處理；陽(yáng)性對(duì)照組投喂基礎(chǔ)飼料，飼養(yǎng)試驗(yàn)結(jié)束后與試驗(yàn)組一起進(jìn)行低溫應(yīng)激處理；3個(gè)試驗(yàn)組分別投喂在基礎(chǔ)飼料中添加0.50%、1.00%、1.50%殼聚糖的試驗(yàn)飼料。

1.2.2 飼養(yǎng)方法 試驗(yàn)在南京曉莊學(xué)院生態(tài)學(xué)省級(jí)重點(diǎn)建設(shè)學(xué)科水產(chǎn)動(dòng)物生理生態(tài)研究室內(nèi)的15個(gè)水族箱（每個(gè)大小為60 cm×45 cm×38 cm）中進(jìn)行。試驗(yàn)開(kāi)始前先將克氏原螯蝦馴養(yǎng)7 d，馴養(yǎng)期投喂另外配制的精制飼料。馴養(yǎng)結(jié)束后，挑選健康狀況良好、大小基本相同、四肢健全的克氏原螯蝦，稱重后隨機(jī)放入15個(gè)水族箱中，每箱8只，雌雄各半，并放置適量水草和帶孔的磚塊供其躲避和休息。各箱隨機(jī)排列，經(jīng)檢驗(yàn)各組克氏原螯蝦的初始體重差異不顯著。試驗(yàn)用水為曝氣后的自來(lái)水。試驗(yàn)期間水溫為室內(nèi)自然溫度，全天持續(xù)充氣增氧。分別于每天清晨和傍晚投喂等量的飼料并做記錄，每次投喂前1 h吸凈前次糞便，投喂量為每箱蝦體重的5%，每周調(diào)整一次投喂量。試驗(yàn)期間每周換水一次，每次換水1/2，以保證水質(zhì)清潔。飼養(yǎng)試驗(yàn)從2011年8月30日開(kāi)始至2011年10月28日結(jié)束，飼養(yǎng)試驗(yàn)結(jié)束后將陽(yáng)性對(duì)照組和3個(gè)試驗(yàn)組的蝦放入4 ℃冰箱中低溫處理5 min，然后取其血清待測(cè)。

1.3 數(shù)據(jù)處理

2 結(jié)果與分析

2.1 殼聚糖對(duì)低溫應(yīng)激下克氏原螯蝦血糖含量的影響

2.2 殼聚糖對(duì)低溫應(yīng)激下克氏原螯蝦血清中CAT、AKP活力的影響

從表1可以看出，飼料中添加殼聚糖對(duì)低溫應(yīng)激下克氏原螯蝦血清中CAT、AKP活力有顯著影響。與陰性對(duì)照組相比，陽(yáng)性對(duì)照組克氏原螯蝦血清中CAT、AKP活力顯著降低。與陽(yáng)性對(duì)照組相比，0.50%殼聚糖組、1.00%殼聚糖組及1.50%殼聚糖組血清中CAT活力均顯著升高，其中0.50%殼聚糖組和1.00%殼聚糖組血清中CAT活力之間無(wú)顯著差異，均顯著高于1.50%殼聚糖組，但3個(gè)試驗(yàn)組CAT活力均顯著低于陰性對(duì)照組。與陽(yáng)性對(duì)照組相比，0.50%殼聚糖組和1.00%殼聚糖組血清中AKP活力均顯著升高，其中0.50%殼聚糖組血清中AKP活力顯著高于1.00%殼聚糖組，而飼料中添加1.50%殼聚糖不能顯著提高低溫應(yīng)激下克氏原螯蝦血清中AKP活力。

3 小結(jié)與討論

3.1 殼聚糖對(duì)低溫應(yīng)激下克氏原螯蝦血糖含量的影響

應(yīng)激反應(yīng)中能量代謝上的改變突出表現(xiàn)為血糖含量的持續(xù)升高，其幅度也與應(yīng)激程度呈正相關(guān)。由于應(yīng)激時(shí)血糖升高的時(shí)效比血漿皮質(zhì)醇更遲緩，也更容易測(cè)定，因此血糖含量被廣泛用來(lái)監(jiān)測(cè)和量化魚(yú)類(lèi)應(yīng)激反應(yīng)[5]。從本研究血糖含量測(cè)定結(jié)果看，陽(yáng)性對(duì)照組的血糖含量比陰性對(duì)照組提高了183.19%，說(shuō)明低溫處理使克氏原螯蝦產(chǎn)生了應(yīng)激反應(yīng)。而添加殼聚糖各組的血糖含量與陽(yáng)性對(duì)照組相比均顯著降低，說(shuō)明添加殼聚糖能夠緩解低溫處理后克氏原螯蝦應(yīng)激反應(yīng)的程度，其中以1.00%殼聚糖組的效果最好，但該組的血糖含量仍顯著高于陰性對(duì)照組，說(shuō)明應(yīng)激反應(yīng)沒(méi)有徹底消除。

3.2 殼聚糖對(duì)低溫應(yīng)激下克氏原螯蝦血清中CAT、AKP活力的影響

CAT是抗氧化系統(tǒng)的終端酶，是細(xì)胞內(nèi)清除自由基的主要酶類(lèi)，它主要通過(guò)將細(xì)胞代謝產(chǎn)生的毒性物質(zhì)H2O2迅速分解為H2O和O2，使體內(nèi)的H2O2維持在一個(gè)平衡狀態(tài)，防止羥自由基的形成[6]。CAT活力的高低可以反映機(jī)體抗氧化體系清除活性氧能力的高低[7]，并且CAT活性與生物的免疫水平密切相關(guān)[8]，常被用作衡量甲殼動(dòng)物免疫狀態(tài)的重要指標(biāo)[9]。AKP作為甲殼動(dòng)物吞噬溶酶體的重要組成部分[10]，是巨噬細(xì)胞溶酶體的標(biāo)志酶[11]，可作為判斷機(jī)體免疫能力的參考數(shù)據(jù)[12]。

從本研究結(jié)果看，陽(yáng)性對(duì)照組的CAT、AKP活力顯著低于陰性對(duì)照組，說(shuō)明低溫處理使克氏原螯蝦的免疫功能?chē)?yán)重受損；而添加殼聚糖各組的CAT、AKP活力明顯高于陽(yáng)性對(duì)照組，說(shuō)明添加殼聚糖能夠提高低溫應(yīng)激狀態(tài)下克氏原螯蝦的免疫功能，其中0.50%殼聚糖組和1.00%殼聚糖組CAT活力較高，0.50%殼聚糖組AKP活力較高，但均顯著低于陰性對(duì)照組，說(shuō)明應(yīng)激反應(yīng)沒(méi)有徹底消除，而飼料中添加1.50%殼聚糖不能顯著提高低溫應(yīng)激下克氏原螯蝦血清中AKP活力。因此，在克氏原螯蝦飼料中添加0.50%～1.00%的殼聚糖可以在一定程度上起到抵抗低溫應(yīng)激的作用。

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