基于ITS序列對萬壽菊葉斑病病原菌的分子鑒定

高山　王孟飛等

摘要：采用改良的CTAB法提取萬壽菊（Tagetes erecta L.）葉斑病病原菌總DNA，以ITS1和ITS4為引物擴(kuò)增病原菌的ITS片段，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物純化后測序并與數(shù)據(jù)庫中的已知序列進(jìn)行BLAST比對，構(gòu)建分子系統(tǒng)發(fā)育樹，對該病原菌進(jìn)行分子鑒定。結(jié)果顯示分離的萬壽菊葉斑病病原菌ITS序列與GenBank中萬壽菊鏈格孢（Alternaria tagetica）AF267134的ITS序列相似度為99%，在分子系統(tǒng)發(fā)育樹上與萬壽菊鏈格孢菌株聚為一支，結(jié)合形態(tài)特征確定分離的萬壽菊葉斑病病原菌為萬壽菊鏈格孢。

關(guān)鍵詞：萬壽菊（Tagetes erecta L.）；葉斑病；ITS；鏈格孢屬（Alternaria）；鑒定

中圖分類號：Q939；S432.4+2；S436.8；S682.1+1 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A 文章編號：0439-8114（2013）09-2074-03

萬壽菊（Tagetes erecta L.）為菊科（Compusitae）萬壽菊屬（Tagetes）一年生草本植物，不僅可用于城市的園林美化，同時也是理想的提純天然黃色素的原料。湖北省恩施土家族苗族自治州為發(fā)展當(dāng)?shù)亟?jīng)濟(jì)、加速新農(nóng)村建設(shè)進(jìn)程，積極建設(shè)萬壽菊種植基地，努力擴(kuò)大種植面積，巴東、鶴峰、咸豐、來鳳等地的萬壽菊種植已形成一定規(guī)模。但萬壽菊易受到葉斑病的危害，發(fā)病率輕時占20%～30%，重則達(dá)70%以上，而且危害周期長、影響范圍廣，難以防治，使萬壽菊的產(chǎn)量和質(zhì)量嚴(yán)重下降[1]，對萬壽菊的規(guī)?；a(chǎn)造成了嚴(yán)重的威脅。

目前對萬壽菊葉斑病原菌的鑒定多采用傳統(tǒng)分類鑒定方法，因形態(tài)、地域的差異，結(jié)論并不一致。如高潔等[1]通過形態(tài)學(xué)、生理生化性狀及生態(tài)學(xué)特征將萬壽菊細(xì)菌性葉斑病的致病菌確定為丁香假單胞菌萬壽菊致病變種（Pseudomonas syringae pv. tagetis）；王龍等[2]則將甘肅地區(qū)萬壽菊葉斑病的病原鑒定為鏈格孢屬（Alternaria sp.）物種。王婷等[3]通過形態(tài)鑒定將萬壽菊葉斑病的病原菌鑒定為細(xì)極鏈格孢（A. tenuissima）。與傳統(tǒng)的形態(tài)學(xué)鑒定方法相比，分子標(biāo)記技術(shù)快速穩(wěn)定，且不易受環(huán)境等因素的影響。ITS序列是核糖體DNA上的轉(zhuǎn)錄單位間隔區(qū)（Internal transcribed spacer，ITS），進(jìn)化中由于不加入成熟核糖體，承受的選擇壓力較小，進(jìn)化相對迅速且具有廣泛的序列多態(tài)性，在其保守性上表現(xiàn)為在種內(nèi)不同菌株間高度保守，而在種間存在明顯差異，這為真菌的分類鑒定和分子檢測提供了豐富的遺傳信息，有利于屬內(nèi)種間或種內(nèi)差異較明顯的菌群間的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系分析[4]。本研究采用ITS分子標(biāo)記結(jié)合形態(tài)學(xué)分類法對萬壽菊葉斑病進(jìn)行鑒定，以期為萬壽菊葉斑病的有效防治提供依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 供試菌株

萬壽菊葉斑病帶病植株采自湖北省恩施土家族苗族自治州巴東縣；病原菌菌株分離后保存于恩施職業(yè)技術(shù)學(xué)院生物工程系微生物實(shí)驗(yàn)室。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 萬壽菊葉斑病病原菌總DNA的提取及檢測 采用改良的CTAB法[5]提取萬壽菊葉斑病病原菌的DNA，0.8%的瓊脂糖凝膠電泳檢測所提取DNA樣品的質(zhì)量。

1.2.3 萬壽菊葉斑病病原菌ITS序列測定 萬壽菊葉斑病病原菌ITS-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物采用UNIQ-10柱式PCR產(chǎn)物回收試劑盒純化后送往生工生物工程（上海）股份有限公司武漢測序部測序，測序要求為單向、正向測序，2個重復(fù)。

1.2.4 萬壽菊葉斑病病原菌ITS序列分析與分子系統(tǒng)樹的構(gòu)建 將測序結(jié)果結(jié)合Chromas軟件查看峰形進(jìn)行糾錯，所得序列在GenBank中進(jìn)行BLAST同源性比對，同時在NCBI中下載同源序列。根據(jù)我國菊科植物上發(fā)現(xiàn)的鏈格孢屬物種[6]以及與鏈格孢屬形態(tài)相似的屬[7]選擇下載序列，共下載ITS序列16條。所有序列采用ClustalX 1.83軟件進(jìn)行多序列比對，應(yīng)用MEGA 4.0軟件采用鄰接法（N-J法）構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，其他參數(shù)默認(rèn)，以釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）為外類群。

2 結(jié)果與分析

2.1 萬壽菊葉斑病病原菌ITS-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳檢測結(jié)果

結(jié)合形態(tài)觀察，萬壽菊葉斑病病原菌菌株培養(yǎng)后可產(chǎn)生分生孢子，呈倒棒狀、具長喙，孢子基本呈鏈狀分布，患病植株葉片上的病斑開始時近圓形或長圓形，褐色，直徑為1～5 mm，后變深褐色至近黑色，常相互愈合致整葉枯死，亦為害小枝和花莖，使病株矮化，或侵染花部使整朵花變黑褐色，與萬壽菊鏈格孢的形態(tài)學(xué)特征一致，從而可確定本研究分離的萬壽菊葉斑病病原菌為萬壽菊鏈格孢。

3 小結(jié)與討論

植物病原菌種類繁多，形態(tài)復(fù)雜且易受環(huán)境的影響，對這些病原菌的鑒定如果僅從形態(tài)學(xué)和生理生化特征來進(jìn)行，有一定的局限性。分子鑒定具有快速、簡便、分辨率高等特點(diǎn)，并可進(jìn)行多相分類，按照種系進(jìn)化的關(guān)系確定精確的位置和定種，可使分類鑒定結(jié)果更加客觀合理[10]。基于ITS序列的分子標(biāo)記技術(shù)靈敏、快速、準(zhǔn)確[11，12]。本研究通過ITS序列分子鑒定，結(jié)合形態(tài)觀察確定分離的萬壽菊葉斑病病原菌為萬壽菊鏈格孢，為萬壽菊葉斑病的綜合防治和萬壽菊種植業(yè)的發(fā)展提供了科學(xué)依據(jù)。

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