利用SSR標(biāo)記鑒定棉花品種和純度研究進(jìn)展

張志勇　詹先進(jìn)等

摘要：概述了SSR標(biāo)記在棉花（Gossypium spp.）的指紋圖譜構(gòu)建、遺傳多樣性分析、品種純度檢測、品種間差異性相關(guān)分析等方面的研究進(jìn)展，并對其應(yīng)用前景進(jìn)行了展望，旨在為今后的研究提供借鑒。

關(guān)鍵詞：棉花（Gossypium spp.）；SSR標(biāo)記；品種；純度

中圖分類號：Q503；S562 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A 文章編號：0439-8114（2013）09-1992-03

棉花是中國重要的經(jīng)濟(jì)作物，高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)新品種的選育在棉花產(chǎn)業(yè)發(fā)展中至關(guān)重要。目前，雜交棉花品種在生產(chǎn)上居主導(dǎo)地位，優(yōu)良的抗蟲雜交棉花品種是農(nóng)民增產(chǎn)增收的基礎(chǔ)。大多數(shù)優(yōu)勢雜交棉花品種是通過人工去雄制種，制種過程中，母本因去雄不徹底或漏去雄易形成自交鈴，這將嚴(yán)重影響雜交種純度。如果不及時準(zhǔn)確地進(jìn)行鑒定，則會給棉花生產(chǎn)帶來嚴(yán)重的損失。因此，雜交棉花品種快速、準(zhǔn)確而高效的純度檢測，對于雜交棉花品種的推廣應(yīng)用意義重大[1]。棉花品種純度的檢測方法有種子形態(tài)學(xué)、幼苗鑒定、蛋白質(zhì)電泳以及田間小區(qū)種植鑒定等方法[2]。隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，各種基于DNA的新型分子標(biāo)記的出現(xiàn)推動了DNA指紋圖譜技術(shù)的快速發(fā)展。DNA指紋圖譜的多態(tài)性反映了基因組DNA間的差異，這種差異受環(huán)境影響較小、數(shù)量多，具有高度的個體特異性。SSR即簡單序列重復(fù)，又稱微衛(wèi)星DNA，是一類由幾個核苷酸為重復(fù)單位組成的簡單串聯(lián)重復(fù)序列。由于SSR多態(tài)性豐富，而且覆蓋整個基因組的編碼區(qū)和非編碼區(qū)，成為一種新興分子標(biāo)記[3]。棉花基因組中存在著豐富的SSR標(biāo)記，SSR標(biāo)記以其獨特的優(yōu)勢，已被廣泛用于棉花的遺傳圖譜構(gòu)建、目標(biāo)基因定位、遺傳多樣性分析、種質(zhì)鑒定及分子標(biāo)記輔助選擇等方面的研究。本文概述了利用SSR標(biāo)記鑒定棉花品種和純度的研究進(jìn)展，皆在為今后的研究提供一定參考。

1 SSR標(biāo)記鑒定不同棉花品種

2001年武耀廷等[4]用48對SSR引物對30個棉花常規(guī)品種、4個雜交品種及其親本進(jìn)行了多態(tài)性篩選。結(jié)果表明，有27對引物檢測到了多態(tài)性，SSR3442、SSR2495、SSR3347和SSR1231引物能夠?qū)⑾骐s2號、皖雜40、中棉所28、南抗3號及親本等30個常規(guī)品種區(qū)分開來，并用SSR標(biāo)記對栽培品種、雜交品種及親本進(jìn)行了多態(tài)性篩選，然后根據(jù)栽培品種及親本SSR指紋圖譜的差異，建立了棉花雜交品種的特征指紋圖譜，應(yīng)用于雜交品種的分子鑒定和純度檢測。朱美霞等[5]應(yīng)用引物組合法，對86-1號、冀棉668、新棉99B、中棉19及中棉12進(jìn)行了純度分析，用特性好的引物J120、J108、J182進(jìn)行三重引物組合對5個品種的250個單株進(jìn)行檢測。結(jié)果表明，三重引物組合不僅可以快速檢測棉花品種的純度而且可以減少試驗工作量。張玉翠等[6]以中國3大棉區(qū)8個棉花主產(chǎn)?。ㄗ灾螀^(qū)）的32個棉花主栽品種為材料，利用SSR標(biāo)記進(jìn)行DNA指紋圖譜的構(gòu)建和遺傳多樣性分析。結(jié)果表明，長江流域棉區(qū)品種間差異最大，黃河流域棉區(qū)次之，新疆棉區(qū)最小，常規(guī)棉種遺傳基礎(chǔ)相較于雜交棉種的遺傳基礎(chǔ)窄。

2 SSR標(biāo)記鑒定棉花品種純度

棉花是常異花授粉作物，其雜交制種容易發(fā)生混雜。為了鑒定棉花品種純度，劉勤紅等[3]以轉(zhuǎn)基因抗蟲雜交棉魯棉研15號母本、父本及其F1代為材料，通過篩選217對棉花異源四倍體的SSR引物，獲得了十幾個區(qū)分魯棉研15號親本及其F1代的標(biāo)記位點，為魯棉研15號雜交種的純度鑒定提供了方法。但該方法不能將魯棉研15號與其他雜交組合區(qū)分開，因為還需要對其親本進(jìn)行指紋分析，只有獲得了雙親特異的分子標(biāo)記，才能夠?qū)υ撈贩N進(jìn)行指紋分析，從而鑒定出假冒種子。殷劍美等[1]利用美國Research Genetics公司設(shè)計的217對專用微衛(wèi)星引物，以蘇雜118及其母本、父本為材料，篩選出12對具有多態(tài)性的引物，其中7對引物在兩親本間擴(kuò)增出大小不同的條帶，均在F1代中表現(xiàn)為雜合帶共顯性標(biāo)記，并構(gòu)建了蘇雜118的SSR指紋圖譜，可將蘇雜118與其他雜交組合區(qū)分開，還可有效區(qū)分蘇雜118兩親本和雜交F1代的基因型，從而進(jìn)行種子純度檢測。為進(jìn)一步研究棉花SSR指紋圖譜，潘兆娥等[7]以雜交棉品種中棉所48及其母本、父本和高世代自交系陸地棉TM-l為材料，利用25對核心引物對中棉所48及其親本進(jìn)行多態(tài)性篩選，共16對引物在兩親本間具有多態(tài)性，其中，14對引物在兩親本間擴(kuò)增出大小不同的條帶，均在F1代中表現(xiàn)為雜合帶共顯性標(biāo)記。用不同材料擴(kuò)增得到的二進(jìn)制數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換成十進(jìn)制數(shù)據(jù)，構(gòu)建了雜交棉中棉所48的數(shù)字指紋圖譜，為該品種的真?zhèn)舞b定和純度檢測提供了方法。

3 SSR標(biāo)記鑒定棉花品種應(yīng)用研究

為進(jìn)一步研究SSR標(biāo)記技術(shù)在棉花品種純度鑒定中的可行性、可靠性和科學(xué)性，科研人員正在積極探索。許蘭杰等[8]以雜交棉花品種興雜2號的父本、母本、雜交株F1代和F2代為材料，選用77對棉花異源四倍體的SSR引物，采用SSR分子標(biāo)記技術(shù)篩選出雙親間的多態(tài)性，結(jié)果有4對引物在興雜2號雙親間擴(kuò)增出多態(tài)性產(chǎn)物，準(zhǔn)確地鑒定出興雜2號及其親本間的差異。其中，CP483引物擴(kuò)增出的兩株雜交株帶型和親本P2帶型完全一致，表明此兩株雜交株是母本去雄不徹底或漏去雄而自交結(jié)子長成的植株。李育強(qiáng)等[9]以12個湘雜棉系列品種（湘雜棉2號至湘雜棉13號）及兩個對照（雜交棉品種魯棉研19和中棉所36）為材料，選擇棉花26對染色體上的331對SSR引物，對湘雜棉系列品種及其部分親本進(jìn)行SSR分析，選擇19對多態(tài)性好、條帶易讀取的SSR引物構(gòu)建了湘雜棉品種指紋圖譜。根據(jù)19對多態(tài)性引物的擴(kuò)增條帶，計算相似系數(shù)并進(jìn)行聚類分析，開展了利用湘雜棉指紋圖譜對未知種身份識別的研究，并用單引物SSR003對湘雜棉2號進(jìn)行了品種純度檢測。匡猛等[10]以中棉所72、中棉所66、中棉所52、中棉所48、中棉所47和中棉所75為材料，選擇棉花26條染色體上的36對SSR核心引物，篩選雙親互補(bǔ)型雜合帶型作為純度檢測標(biāo)記，采用單位點平均法與雙位點差異法統(tǒng)計SSR標(biāo)記檢測結(jié)果；在棉鈴期考察棉花株型、鈴形、葉形、花及莖等性狀，比對田間表型與分子檢測結(jié)果，并進(jìn)行相關(guān)性分析。結(jié)果表明，有34對核心引物在6個雜交株上獲得101個雜合位點，平均每個雜交株具有16.8個。田間表型鑒定結(jié)果高于分子標(biāo)記檢測結(jié)果，單位點平均法的相關(guān)性高于雙位點差異法。純合度高的親本將會增加分子標(biāo)記鑒定結(jié)果與表型鑒定結(jié)果的相關(guān)性，為DNA指紋技術(shù)應(yīng)用于棉花品種鑒定做了基礎(chǔ)性研究。

4 展望

隨著雜交棉花品種的逐漸增多以及親本間遺傳基礎(chǔ)日漸狹窄，采用田間調(diào)查品種性狀的方法因耗時長、成本高、效果差而特別容易受到環(huán)境條件的影響。而以分子標(biāo)記為基礎(chǔ)的DNA指紋鑒定技術(shù)具有準(zhǔn)確、快速、易于操作等優(yōu)點，通過構(gòu)建DNA指紋圖譜快速鑒定品種及純度是品種鑒定技術(shù)實現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化的前提，成為品種鑒定技術(shù)的研究熱點。以微衛(wèi)星為基礎(chǔ)的SSR標(biāo)記在DNA指紋鑒定上顯示了特有的優(yōu)越性，已在大豆[11]、水稻[12]、小麥[13]、玉米[14]和油菜[15]等主要農(nóng)作物上進(jìn)行應(yīng)用研究。目前利用SSR標(biāo)記方法對棉花品種鑒定的研究有很多報道，被研究的棉花品種覆蓋面廣，涉及中國3大棉區(qū)，為今后棉花品種純度檢測打下了基礎(chǔ)。在品種選育過程中常因親本自交代數(shù)不夠，存在親本未完全純合穩(wěn)定的現(xiàn)象，導(dǎo)致某些遺傳位點還存在變異，但這些未純合的位點不一定直接反映在表型性狀上，因此使用這些未純合的標(biāo)記位點進(jìn)行純度檢測的結(jié)果往往與田間形態(tài)鑒定的結(jié)果存在差異。為進(jìn)一步提高SSR標(biāo)記鑒定棉花品種的準(zhǔn)確性，仍需要對特異性引物進(jìn)行不斷篩選，結(jié)合不同棉花品種間表型差異進(jìn)行相關(guān)研究。

參考文獻(xiàn)：

[1] 殷劍美，陳旭升，狄佳春，等.雜交棉蘇雜118的SSR指紋圖譜構(gòu)建[J].江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2007（4）：29-31.

[2] 高 翔，查春宏，艾克拜爾，等.棉花種子純度鑒定技術(shù)[J].種子科技，2006，24（3）：52-53.

[3] 劉勤紅，王芙蓉，張 軍，等.利用SSR標(biāo)記鑒定魯棉研15號雜交種純度的研究[J].山東農(nóng)業(yè)科學(xué)，2003（2）：7-9.

[4] 武耀廷，張?zhí)煺?，郭旺珍，?陸地棉品種SSR標(biāo)記的多態(tài)性及用于雜交種純度檢測的研究[J].棉花學(xué)報，2001，13（3）：131-133.

[5] 朱美霞，李英芝，王建書，等.利用SSR方法鑒定棉花品種純度[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2005，33（11）：2010-2016.

[6] 張玉翠，楊偉華，匡 猛，等.32個棉花主栽品種DNA指紋圖譜構(gòu)建及遺傳多樣性分析[J].棉花學(xué)報，2012，24（2）：120-126.

[7] 潘兆娥，王希文，孫君靈，等.中棉所48的SSR數(shù)字指紋圖譜的構(gòu)建[J].中國農(nóng)學(xué)通報，2010，26（7）：31-35.

[8] 許蘭杰，聶戰(zhàn)勝，詹克慧.利用SSR標(biāo)記鑒定棉花雜交種興雜2號純度的研究[J].中國農(nóng)學(xué)通報，2008，24（6）：202-206.

[9] 李育強(qiáng)，陳浩東，洪亞輝，等. 湘雜棉SSR指紋圖譜的構(gòu)建及應(yīng)用[J].棉花學(xué)報，2009，21（3）：175-178.

[10] 匡 猛，楊偉華，張玉翠，等. 棉花雜交種純度的SSR標(biāo)記檢測及其與田間表型鑒定的相關(guān)性[J].作物學(xué)報，2011，37（12）：2299-2305.

[11] 關(guān)榮霞，劉 燕，劉章雄，等.利用SSR方法鑒定大豆品種純度[J].分子植物育種，2003，1（3）：357-360.

[12] 辛業(yè)蕓，張 展，熊易平，等. 應(yīng)用SSR分子標(biāo)記鑒定超級雜交水稻組合及其純度[J].中國水稻科學(xué)，2005，19（2）：95-100.

[13] 王立新，常利芳，李宏博，等. 小麥種子純度的分子標(biāo)記檢測方法[J].麥類作物學(xué)報，2009，29（1）：1-8.

[14] 李汝玉，李 群，譚振馨，等.利用SSR標(biāo)記技術(shù)檢測玉米雜交種純度[J].玉米科學(xué)，2005，13（1）：15-18.

[15] 陸光遠(yuǎn)，伍曉明，張冬曉，等.SSR標(biāo)記分析國家油菜區(qū)試品種的特異性和一致性[J].中國農(nóng)業(yè)科學(xué)，2008，41（1）：32-42.