一種簡(jiǎn)單高效的水稻體細(xì)胞誘變育種新方法

林建中　楊遠(yuǎn)柱　周波　符辰建　杜長(zhǎng)青　胡小淳

摘要：多樣化種質(zhì)資源的利用對(duì)于培育高產(chǎn)和理想農(nóng)藝性狀水稻品種顯得非常重要.在本研究中，通過(guò)研究繼代時(shí)間、2，4D濃度和不同外植體對(duì)誘變和分化頻率的影響，建立了幼穗為外植體、繼代培養(yǎng)時(shí)間為3個(gè)周期（約75 d）以及2，4D的最佳誘變濃度為4.0 mg/L的體細(xì)胞誘變育種方法.然后利用該方法誘變雜交水稻親本株1S和中9B，分別成功選育了優(yōu)良矮化突變株系SV14S和SV9B，為后續(xù)的雜交育種提供了優(yōu)質(zhì)種質(zhì)資源.這些育種成果的取得進(jìn)一步證實(shí)了該水稻體細(xì)胞誘變育種方法是一種簡(jiǎn)單高效的新型育種方法.

關(guān)鍵詞：突變；水稻（Oryza sativa L.）； 組織培養(yǎng)； 2，4D； 育種

中圖分類號(hào)：S336 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

水稻（Oryza sativa L.）是世界上重要的經(jīng)濟(jì)谷類作物，有超過(guò)一半的世界人口以大米作為主食.然而，隨著人口的不斷增長(zhǎng)和耕地的減少，據(jù)估計(jì)到2030年大米的需求將比現(xiàn)在提高40%_[1].因此，很有必要通過(guò)各種育種方法以提高水稻產(chǎn)量.

育種是一個(gè)從大量株系中篩選出理想表型株系的過(guò)程，這些大量的株系一般來(lái)源于自然和人工突變以及雜交重組.因突變可能產(chǎn)生的優(yōu)良種質(zhì)是育種的一個(gè)重要來(lái)源.多樣化的種質(zhì)資源對(duì)水稻育種非常重要，如提高產(chǎn)量以及其他農(nóng)藝性狀的改良等[2-3].然而，優(yōu)良品種的篩選需要大量原始育種材料，因而采用新的方法來(lái)獲得大量多樣化的候選株系就顯得非常重要.體細(xì)胞無(wú)性系變異作為一個(gè)新的變異來(lái)源，引起了遺傳學(xué)家和育種學(xué)家的大量關(guān)注_[4].許多作物包括玉米和水稻_[5]等已被用于組織培養(yǎng)和體細(xì)胞無(wú)性系變異研究_[5-7]，為作物育種提供了一種新的誘變途徑.體細(xì)胞的誘導(dǎo)突變能夠獲得相當(dāng)豐富的遺傳變異，又因其容易應(yīng)用和推廣而具有很高的實(shí)用價(jià)值[8-9].突變體因染色體數(shù)目改變、點(diǎn)突變、結(jié)構(gòu)性染色體重排等原因而引起表型改變，而且該表型還可以穩(wěn)定遺傳.因此，以此為基礎(chǔ)可以培育新的作物優(yōu)良品種.

體外培養(yǎng)誘導(dǎo)突變所涉及的因素包括培養(yǎng)基的成分（各種鹽類、激素和有機(jī)物質(zhì)等）和培養(yǎng)條件（溫度、光照和培養(yǎng)時(shí)間等）_[10].誘變?cè)斐山M織培養(yǎng)細(xì)胞的突變可能是一個(gè)或多個(gè)誘變因素.迄今，在水稻誘變育種方面還未見(jiàn)以高濃度2，4D為誘變劑的誘變育種方法的報(bào)道.在本研究中，我們分別研究了繼代培養(yǎng)時(shí)間、2，4D濃度和不同外植體對(duì)突變頻率的影響，建立了一種以幼穗為外植體和4.0 mg/ L 2，4D誘變處理的水稻體細(xì)胞無(wú)性系誘變育種方法.同時(shí)，利用該誘變方法從水稻品種株1S和中9B中分別成功選育了2個(gè)穩(wěn)定的優(yōu)良矮稈突變株系SV14S 和 SV9B，并進(jìn)一步證實(shí)了該水稻體細(xì)胞誘變育種方法的有效性.

1材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)材料

本研究所用的植物材料為4個(gè)秈稻品種株1S，中9B，316B和R527，均為華南地區(qū)的雜交水稻骨干親本.株1S為湖南省株州市農(nóng)科所培育的秈型光溫敏核不育水稻 [11]

1.2.5不同外植體對(duì)誘變頻率的影響

分別選取株1S的幼穗、幼胚和成熟胚作為外植體誘導(dǎo)愈傷組織.先繼代1個(gè)周期，然后在4.0 mg/L 2，4D的MS培養(yǎng)基上誘變1個(gè)周期.其后的步驟與2，4D濃度對(duì)誘變頻率影響的實(shí)驗(yàn)方法相同.最后分別統(tǒng)計(jì)3種外植體對(duì)誘變頻率的影響.

1.2.6矮稈突變體的篩選和表型鑒定

具體方法參照我們先前發(fā)表的一篇論文_[14]，主要于R2代考查其株高性狀，并觀察其性狀分離情況.對(duì)于比原親本水稻株高有所降低而且能穩(wěn)定遺傳的突變株系，于抽穗期套袋使其自交結(jié)實(shí)和采收種子（R3），同時(shí)考察和評(píng)價(jià)其農(nóng)藝性狀.對(duì)符合目標(biāo)性狀且穩(wěn)定遺傳的變異株即為優(yōu)良誘變品種（系）.

1.2.7莖的單位長(zhǎng)度干物質(zhì)含量分析

于成熟期分別隨機(jī)選擇株1S和SV14S各20株，先測(cè)量整個(gè)莖稈的長(zhǎng)度，然后將各節(jié)間分開，分別測(cè)量各節(jié)間長(zhǎng)度.將各節(jié)間再置于50 °C烘箱烘烤16 h，于分析天平稱取各節(jié)間重量.最后，根據(jù)所得的數(shù)據(jù)，計(jì)算整個(gè)莖稈和各節(jié)間重量（mg）/長(zhǎng)度（cm）的比值.另外，統(tǒng)計(jì)突變株系SV14S的重量（mg）/長(zhǎng)度（cm）比值的增加率.其計(jì)算公式為：增加率=[SV14S的比值（mg/cm）-株1S的比值（mg/cm）]/株1S的比值（mg/cm）×100%.

2結(jié)果與討論

2.1繼代時(shí)間對(duì)植株再生的影響

已有研究發(fā)現(xiàn)_[15]，組織培養(yǎng)的體細(xì)胞變異頻率隨培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)而提高.但是隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，其愈傷組織的分化頻率也急劇下降，往往導(dǎo)致再生苗分化的極度困難.因此，我們首先研究了繼代時(shí)間對(duì)植株再生的影響，以尋找愈傷組織的最佳繼代時(shí)間.以25 d為一個(gè)培養(yǎng)周期，挑取剛從株1S幼穗誘導(dǎo)出來(lái)的顏色淡黃、質(zhì)地致密的胚性愈傷組織于繼代培養(yǎng)基進(jìn)行繼代培養(yǎng)，分別繼代0～9個(gè)周期，然后轉(zhuǎn)接到分化培養(yǎng)基上觀察并統(tǒng)計(jì)分化頻率.其中，繼代0周期的胚性愈傷組織即為剛從幼穗誘導(dǎo)出來(lái)的胚性愈傷組織轉(zhuǎn)接到分化培養(yǎng)基.實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，當(dāng)繼代4個(gè)周期以上，其愈傷組織的分化頻率急劇下降，由繼代3個(gè)周期時(shí)的59.0%急降至15.8%左右（圖2（a））.因此，為了保持較高的分化頻率和變異頻率（由繼代時(shí)間決定），我們認(rèn)為在高濃度2，4D誘變處理前的最佳繼代時(shí)間為3個(gè)周期.

2.3不同外植體對(duì)誘變頻率的影響

在水稻組織培養(yǎng)中，一般選用幼穗、幼胚和成熟胚作為外植體_{[13，16-17]}.在3種外植體中，究竟哪種最適合作為體細(xì)胞無(wú)性系變異的外植體呢？迄今還未見(jiàn)相關(guān)研究?jī)?nèi)容的文獻(xiàn)報(bào)道.于是我們研究了水稻幼穗、幼胚和成熟胚等3種外植體對(duì)誘變頻率的影響.研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，由幼穗誘導(dǎo)的愈傷組織的誘變頻率達(dá)到了24.7%，由幼胚誘導(dǎo)的為5.2%，而由成熟胚誘導(dǎo)的僅為3.8% （圖2（c））.在單一性狀的變異方面，由幼穗誘導(dǎo)的愈傷組織的誘變頻率也很高.如由株1S幼穗誘導(dǎo)、誘變和再分化得到的500株分化苗中，經(jīng)在海南陵水基地的表型鑒定，發(fā)現(xiàn)共有24株表現(xiàn)出株高不同程度的矮化.就株高性狀的變化來(lái)說(shuō)，其突變率達(dá)到了4.8% （24/500）（表2）.而由成熟胚誘導(dǎo)的愈傷組織經(jīng)誘變和再分化后得到的分化苗中，幾乎沒(méi)有發(fā)現(xiàn)矮化突變株（結(jié)果未列出）.由此可以看出，在體細(xì)胞無(wú)性系誘變的外植體中，幼穗明顯優(yōu)于幼胚和成熟胚.其可能的原因是處于花粉母細(xì)胞形成時(shí)期的水稻細(xì)胞在離體培養(yǎng)條件下對(duì)外界環(huán)境更敏感，更易發(fā)生變異.另外，幼穗作為外植體還有具有愈傷組織誘導(dǎo)率高和活力強(qiáng)等優(yōu)勢(shì)（結(jié)果未列出）.因此，體細(xì)胞無(wú)性系誘變育種的最佳外植體為幼穗.

2.4不同品種的體細(xì)胞突變頻率的分析

通過(guò)上面以株1S為材料進(jìn)行的繼代時(shí)間、2，4D濃度和不同外植體對(duì)誘變和分化頻率的影響，初步建立了以幼穗為外植體，以4.0 mg/L 2，4D為最佳誘變濃度的體細(xì)胞無(wú)性系誘變方法.為了進(jìn)一步驗(yàn)證該方法的有效性，我們對(duì)包括株1S在內(nèi)的水稻品種中9B，R527和316B等進(jìn)行了無(wú)性系誘變.為了實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)確性，僅以單一性狀的突變進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析.在生產(chǎn)中，株1S，中9B和R527的株高偏高，導(dǎo)致所配組合抗倒伏性差，而316B的種子穎殼閉合度差，容易導(dǎo)致種子霉變和發(fā)芽率降低.因此，在株1S，中9B和R527中，以矮稈或半矮稈突變株系進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，而316B則以種子穎殼閉合度好的突變株系進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析.實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，誘變頻率最高的是株1S，在500株分化苗中共得到了24個(gè)矮化變異株系，其誘變頻率達(dá)到了4.8% （24/500）.誘變效率最低的是316B，在236株分化苗中僅得到了1個(gè)種子穎殼閉合度較好的突變株系，其誘變頻率僅為0.42% （1/236）.中9B和R527分別為2.33%和1.42% （表2）.由此說(shuō)明，體細(xì)胞無(wú)性系的突變率還取決于品種間的基因型差異.

2.5矮稈突變株系的表型分析

在株1S的24個(gè)SV矮化突變株系中，選取了SV5S，SV10S和SV14S等3個(gè)綜合農(nóng)藝性狀較優(yōu)的變異株系，對(duì)它們的株高和各節(jié)間長(zhǎng)度進(jìn)行了分析.由于在不育狀態(tài)時(shí)不育系水稻的穗不能完全從旗葉的葉鞘中伸展出來(lái)，對(duì)植株高度的測(cè)量產(chǎn)生很大的影響[18-19].因此，親本株1S和其SV突變體（R3）都是經(jīng)20 ℃低溫處理使其育性恢復(fù)后于成熟期測(cè)量株高及節(jié)間長(zhǎng)度（表3）.從表中的統(tǒng)計(jì)結(jié)果可知，在株高上出現(xiàn)株1S，SV10S，SV14S和SV5S依次變矮的順序，其節(jié)間特別是基部的節(jié)間明顯縮短，而穗長(zhǎng)卻縮短幅度很小.該結(jié)果說(shuō)明，矮化突變體能顯著提高抗倒伏性.通過(guò)進(jìn)一步綜合農(nóng)藝性狀的鑒定和評(píng)價(jià)，發(fā)現(xiàn)SV14S的各種農(nóng)藝性狀更加優(yōu)良_[13].于是我們檢測(cè)了株1S和SV14S各節(jié)間及整個(gè)莖稈的單位長(zhǎng)度干物質(zhì)含量，以進(jìn)一步研究SV14S的抗倒伏能力.實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，除了第一節(jié)間外，SV14S其它節(jié)間的單位長(zhǎng)度干物質(zhì)含量均比親本株1S高（表4）.該結(jié)果說(shuō)明，突變體SV14S既能增加抗倒伏性，又能提高產(chǎn)量.雜交配組實(shí)驗(yàn)也進(jìn)一步說(shuō)明了SV14S的優(yōu)良抗倒伏性能.如SV14S與恢復(fù)系912的雜種后代（F1）的抗倒伏性明顯優(yōu)于株1S與912的雜種后代（結(jié)果未列出）.因此，突變株系SV14S在雜交水稻育種中具有良好的應(yīng)用前景.另外，我們還對(duì)突變株系SV14S進(jìn)行了相關(guān)分子生物學(xué)分析，并在基因水平上證明該突變體確實(shí)發(fā)生了穩(wěn)定變異，具體結(jié)果見(jiàn)先前發(fā)表的相關(guān)文章_{[14， 20-21]}.

在中9B的5個(gè)SV矮化突變株系中，經(jīng)過(guò)3～4代的考察和評(píng)價(jià)，選取了其中綜合農(nóng)藝性狀最優(yōu)的矮化株系命名為SV9B，并對(duì)其農(nóng)藝性狀進(jìn)行了考察和評(píng)價(jià).圖3顯示了SV9B和對(duì)照親本中9B的植株形態(tài)、株高和各節(jié)間長(zhǎng)度.從圖可知，中9B和SV9B的植株高度分別為93 cm和75 cm， SV9B的株高明顯低于對(duì)照親本中9B（圖3（a）和（b）），而且SV9B的各節(jié)間均縮短，其中基部節(jié)間長(zhǎng)度縮短明顯，而上部節(jié)間長(zhǎng)度縮短幅度較?。▓D3（c）和（d））.特別是SV9B的III節(jié)間的縮短幅度最大，還不到中9B的III節(jié)間長(zhǎng)度的一半.另外，我們還測(cè)量了中9B和SV9B成熟穗的農(nóng)藝性狀（圖4和表5），發(fā)現(xiàn)與對(duì)照親本中9B相比，SV9B的穗長(zhǎng)幾乎沒(méi)有變化，初級(jí)小穗數(shù)和千粒重稍微降低，而次級(jí)小穗數(shù)和每穗粒數(shù)卻顯著增加.同時(shí)，SV9B的種子比中9B的種子更加飽滿（圖4（c））.這些結(jié)果說(shuō)明，突變體SV9B不僅增加了抗倒伏性，而且提高了單株產(chǎn)量，具有良好的應(yīng)用前景.

優(yōu)良矮稈突變株系SV14S和SV9B的成功選育為后續(xù)的傳統(tǒng)雜交育種提供了優(yōu)質(zhì)種質(zhì)資源.隨后，以SV14S與優(yōu)質(zhì)抗稻瘟病父本ZR02雜交，通過(guò)“人工低溫與自然低溫雙重壓力選擇”和定向培育，育成優(yōu)質(zhì)兩用核不育系湘陵628S （品種授權(quán)號(hào)：CNA20070803.1）.用該親本選配的雜交組合在國(guó)家和湖南省區(qū)試評(píng)比中農(nóng)藝性狀表現(xiàn)優(yōu)異（結(jié)果未列出），已獲準(zhǔn)大面積商業(yè)推廣.如超級(jí)雜交早稻組合陵兩優(yōu)268，兩年國(guó)家區(qū)試第一名，已通過(guò)國(guó)家審定.同樣，利用SV9B與三系胞質(zhì)不育系T98A測(cè)交、多代回交選育出抗倒伏的優(yōu)質(zhì)三系胞質(zhì)不育系SV916A，利用該親本選育的優(yōu)質(zhì)超級(jí)雜交稻組合即將應(yīng)用于生產(chǎn).總之，這些卓有成效的育種成果的取得進(jìn)一步證實(shí)，利用幼穗為外植體和2，4D為誘變劑的水稻體細(xì)胞誘變育種方法是一種簡(jiǎn)單有效的新型育種方法.同時(shí)也說(shuō)明，在整個(gè)誘變和后續(xù)的選育過(guò)程中，如果結(jié)合一定的選擇壓力可以有效加快育種進(jìn)程.

3 結(jié)論

在本研究中，通過(guò)研究繼代時(shí)間、2，4D濃度和不同外植體對(duì)誘變和分化頻率的影響，初步建立了以幼穗為外植體、誘變前繼代培養(yǎng)時(shí)間為3個(gè)周期（約75 d）以及以4.0 mg/L 2，4D為最佳誘變濃度的體細(xì)胞誘變育種方法.同時(shí)，利用該方法誘變株1S和中9B，分別成功選育到了優(yōu)良矮化突變株系SV14S和SV9B，為后續(xù)的傳統(tǒng)雜交育種提供了優(yōu)質(zhì)種質(zhì)資源.這些育種成果的取得進(jìn)一步證實(shí)了該水稻體細(xì)胞誘變育種方法是一種簡(jiǎn)單有效的新型育種方法.

參考文獻(xiàn)

[1]KHUSH G S. What it will take to feed 5.0 billion rice consumers in 2030[J]. Plant Mol Biol， 2005， 59： 1-6.

[2]AHLOOWALIA B S， MALUSZYNSKI M. Induced mutationsA new paradigm in plant breeding[J]. Euphytica， 2001， 118： 167-173.

[3]JIANG S Y， BACHMANN D， LA H， et al. Ds insertion mutagenesis as an efficient tool to produce diverse variations for rice breeding[J]. Plant Mol Biol， 2007， 65： 385-402.

[4]MALUSZYNSKI M， BEANT S， AHLOOWALIA B S. Application of in vivo and in vitro mutation techniques for crop improvement[J]. Euphytica， 1995， 100： 1-13.

[5]WU D， SHU Q， XIA Y. In vitro mutagenesis induced novel thermo/ photoperiodsensitive genic male sterile indica rice with greenrevertible xanthan leaf color marker[J]. Euphytica， 2002， 123： 195-202.

[6]GENGENBACH B G， GREEN C E， DONOVAN C M. Inheritance of selected pathotoxin resistance in maize plants regenerated from cell cultures[J]. Proc Natl Acad Sci USA， 1977， 74： 5113-5117.

[7]VENKATAIAH P， CHRISTOPHER T， KARAMPURI S. Selection of atrazineresistant plants by in vitro mutagenesis in pepper （Capsicum annuum）[J]. Plant Cell Tiss Organ Cult， 2005， 83： 75-82.

[8]CHALEFF R S. Isolation of agronomically useful mutants from plant cell cultures[J]. Science， 1983， 214： 676-682.

[9]LARKIN P J， RYAN S A， BRETTELL R L， et al. Heritable somaclonal variation in wheat[J]. Theor Appl Genet， 1984， 67： 443-455.

[10]LING D H， MA Z R， CHEN W Y， et al. Male sterile mutant from somatic cell culture of rice[J]. Theor Appl Genet， 1987， 75： 127-131.

[11]楊遠(yuǎn)柱， 唐平徠，楊文彩，等. 水稻廣親和低溫敏兩用核不育系株lS的選育及應(yīng)用技術(shù)[J]. 雜交水稻， 2000， 3： 57-60.

[12]MURASHIGE T， SKOOG F. A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue cultures[J]. Physiol Plantarum， 1962， 15： 473-497.

[13]劉選明， 楊遠(yuǎn)柱， 陳彩艷， 等. 利用體細(xì)胞無(wú)性系變異篩選水稻株1S矮桿突變體研究[J]. 中國(guó)水稻科學(xué)， 2002， 18（4）： 321-325.

[14]林建中， 楊遠(yuǎn)柱， 趙小英， 等. 一種優(yōu)良半矮稈水稻品種的分離與分子鑒定[J]. 湖南大學(xué)學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版， 2010， 37（8）： 66-73.

[15]游晴如， 黃庭旭， 張水金， 等. 植物誘變新技術(shù)及其在水稻育種上的應(yīng)用[J]. 江西農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)， 2003， 15（2）： 43-47.

[16]LIN Y， ZHANG Q. Optimizing the tissue culture conditions for high efficiency transformation of indica rice[J]. Plant Cell Rep， 2005， 23： 540-547.

[17]LIN J Z， ZHOU B， YANG Y Z， et al. Piercing and vacuum infiltration of the mature embryo： a simplified method for agrobacterium mediated transformation of indica rice[J]. Plant Cell Reports， 2009， 28： 1065-1074.

[18]KOH H J， SON Y H， HEU M H， et al. Molecular mapping of a new genic malesterility gene causing chalky endosperm in rice （Oryza sativa L.）[J]. Euphytica， 1999， 106： 57-62.

[19]DONG N V， SUBUDHI P K， LUONG P N， et al. Molecular mapping of rice gene conditioning thermosensitive genic male sterility using AFLP， RFLP and SSR techniques[J]. Theor Appl Genet， 2000， 100： 727-734.

[20]劉選明， 林建中， 楊遠(yuǎn)柱， 等. 7種水稻光溫敏核不育系品種（系）的RAPD多態(tài)性分析[J]. 湖南大學(xué)學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版， 2003， 30（1）： 1-4.

[21]袁小川， 楊遠(yuǎn)柱， 劉選明， 等. 雄性核不育水稻矮稈突變體突變分子機(jī)制的初步研究[J]. 生命科學(xué)研究， 2005， 9（2）： 141-144.