DNA條形碼技術(shù)在肉品防欺詐鑒別中的應(yīng)用

邱德義 胡佳等

摘 要：以DNA條形碼技術(shù)鑒別進(jìn)出口監(jiān)督抽檢的魚肉等水產(chǎn)制品的種類來源，用以判別其與申報或產(chǎn)品標(biāo)簽是否相符。分別提取魚肉等樣品的基因組DNA，以目前國際上比較公認(rèn)的動物線粒體細(xì)胞色素氧化酶CO Ⅰ基因通用引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR產(chǎn)物經(jīng)測序分析后，將得到的擴(kuò)增片段序列與Genbank數(shù)據(jù)庫進(jìn)行序列比對，同時提交Barcoding Life DNA條形碼數(shù)據(jù)庫（BOLD）進(jìn)行鑒定分析。本批次監(jiān)督抽檢的16份魚肉、魚丸等水產(chǎn)制品中除1份樣品未能成功獲得魚肉CO Ⅰ PCR擴(kuò)增外，其余15份樣品均順利得到種類來源鑒定，鑒定結(jié)果約有31.25%的樣品與產(chǎn)品標(biāo)簽標(biāo)示不符。作為一種簡單、快速、有效的分子鑒定技術(shù)，DNA條形碼可以直接應(yīng)用于魚肉等動物源性食品的種類鑒定。

關(guān)鍵詞：DNA條形碼；冷凍魚肉；動物源性食品；種類鑒定

中圖分類號：Q95 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：B 文章編號：1001-8123（2013）04-0040-04

《晏子春秋：內(nèi)篇雜下第一》中就有“懸牛首賣馬肉”之說，民間也有“掛羊頭賣狗肉”的演繹，其根本內(nèi)涵就是：表里不一、狡詐欺騙。在商貿(mào)領(lǐng)域表現(xiàn)為以次充好，甚至假冒、仿造貴重物品，欺騙消費(fèi)者從而達(dá)到獲取更高非法利益的真實(shí)目的。進(jìn)入2013年，在有著最嚴(yán)格食品安全監(jiān)管制度的歐盟，真實(shí)演繹了席卷歐洲列國的牛肉標(biāo)識欺詐事件。不僅涉及到食品摻假欺詐的商業(yè)行為而且涉及到民族和宗教信仰的問題，引起不食用馬肉和豬肉的穆斯林和猶太人的強(qiáng)烈不滿。馬肉也引發(fā)食品安全的擔(dān)憂，部分馬肉中已檢測出苯基丁氮酮藥物殘留，此藥物經(jīng)常用于馬類，有助于止痛和退熱，但對人類有害。受“馬肉風(fēng)波”事件影響，被忽視多年的海鮮產(chǎn)品以次充好現(xiàn)象也再度浮出水面。

摻假造假的判定和標(biāo)簽制度的有效實(shí)施，必須建立在快速、準(zhǔn)確的食品物種鑒定的基礎(chǔ)上。對加工食品而言，物種的原始可識別形態(tài)特征消失，這使得物種的鑒別變得相對困難。因此，迫切需要一些靈敏、可靠的檢測方法來鑒定動物食品或動物源性加工食品的物種來源。

DNA條形碼技術(shù)（Barcoding）是近幾年興起的一種分子生物學(xué)新技術(shù)，原理是利用基因組DNA中一段標(biāo)準(zhǔn)的或者被公認(rèn)的基因片段，作為分子靶標(biāo)來進(jìn)行種級水平的種類鑒定。DNA條形碼技術(shù)對鑒定者的經(jīng)驗(yàn)和專業(yè)知識背景要求較低，為物種的鑒定提供了新的手段，彌補(bǔ)了傳統(tǒng)分類的諸多不足。但條形碼鑒別技術(shù)需要有專門的數(shù)據(jù)庫作為支撐，含有較全面的生物學(xué)信息[1-2]。

利用分子標(biāo)記進(jìn)行物種種類鑒定國際上已有不少的嘗試，Hebert等[3-4]于2003年發(fā)表了國際上第一篇利用DNA 條形碼進(jìn)行物種鑒定的論文，隨后Ball等[5]嘗試用分子條形碼鑒別了70多種水生蜉蝣，游中華等[6]用線粒體CO I鑒別了入侵害蟲西花薊馬及其他8種常見薊馬；岳巧云等[7-8]將DNA條形碼技術(shù)應(yīng)用于出入境檢驗(yàn)檢疫把關(guān)，成功對醫(yī)學(xué)媒介生物進(jìn)行種類鑒定并建立數(shù)據(jù)庫。Wong等[9]利用DNA 條形碼技術(shù)對市場上的91個海產(chǎn)品樣品進(jìn)行分析，推斷出可能有25%海產(chǎn)品的標(biāo)簽與實(shí)物不符，認(rèn)為DNA 條形碼技術(shù)是一種經(jīng)濟(jì)的、有效的、可將海產(chǎn)品鑒定到種的分子鑒別技術(shù)。在我國，DNA條形碼技術(shù)用于食品鑒別的文獻(xiàn)報道較少，常見的動物源成分鑒定技術(shù)應(yīng)用的是特異PCR、熒光PCR等技術(shù)，也頒布了一部分行業(yè)檢測標(biāo)準(zhǔn)，但其局限性顯而易見。柳淑芳等[10]報道了DNA條形碼技術(shù)在魚類系統(tǒng)分類中的應(yīng)用，為該項(xiàng)技術(shù)在魚種類鑒別中的應(yīng)用前景提供了有力支持。

本實(shí)驗(yàn)室應(yīng)用線粒體CO Ⅰ片段為靶標(biāo)，CO Ⅱ、CO III以及ITS等作為備用標(biāo)靶和確證基因，對進(jìn)出口監(jiān)督抽檢及口岸截獲的多批次包括魚肉、魚片、蝦餃、魚丸等水產(chǎn)和水產(chǎn)制品進(jìn)行檢測鑒定，并通過分析比對進(jìn)行了確認(rèn)。龍利魚（Cynoglossus macrolepidotus） 自然資源量少，味道鮮美，為一種高檔海鮮。本實(shí)驗(yàn)將以其中一份申報為龍利魚柳凍魚肉的檢測鑒定作為典型范例，對DNA條形碼技術(shù)在進(jìn)出口檢驗(yàn)監(jiān)管方面的應(yīng)用做一分析和介紹。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

研究樣本為從各進(jìn)出口食品企業(yè)監(jiān)督抽檢的多批次包括魚肉、魚片、蝦餃、魚丸、蝦醬等水產(chǎn)和水產(chǎn)制品以及口岸截獲的冷凍魚肉。

動物組織基因組DNA 提取試劑盒、PCR產(chǎn)物及DNA片段回收試劑盒、T4連接試劑盒、DH5α感受態(tài)細(xì)胞 天根生化科技北京有限公司；EX-Taq DNA聚合酶、dNTP等PCR試劑 寶生物工程（大連）有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

Sigma 1-15pk冷凍離心機(jī) 德國Sigma公司；S1000梯度PCR儀、Gel DocTM XR+凝膠成像系統(tǒng) 美國Bio-Rad公司；DYCP-31E電泳儀 北京六一儀器廠； NanoDrop 1000微量核酸蛋白測定儀 美國Thermo公司。

1.3 方法

1.3.1 DNA提取

魚肉基因組DNA提取均采用動物組織基因組DNA 提取試劑盒，按照試劑盒使用手冊進(jìn)行基因組DNA提取，對個別魚肉樣品適當(dāng)延長蛋白酶消解時間。

1.3.2 PCR擴(kuò)增

PCR擴(kuò)增所用引物為：LCO1490 5-GGTCAACAAATCATAAAGATATTGG-3，HCO2198 5-TAAACTTCAGGGTGACCAAAAAATCA-3[10-11]，由寶生物工程（大連）有限公司合成。

PCR反應(yīng)體系（50?L）：10倍PCR緩沖液5?L；正向引物（20?mol/L）2.5?L；反向引物（20?mol/L）2.5?L；dNTP（10mmol/L）1.5?L；Ex-Taq 1?L；模板DNA 2?L；無菌水定容到50?L。

EX-Taq DNA聚合酶擴(kuò)增條件：94℃變性5min；94℃、40s，54℃、40s，72℃、1min，反應(yīng)40個循環(huán)；72℃延伸10min。

PCR 擴(kuò)增完成后，經(jīng)1%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳分離后，使用數(shù)碼凝膠成像系統(tǒng)分析擴(kuò)增產(chǎn)物。

1.3.3 PCR產(chǎn)物測序

PCR產(chǎn)物直接測序時，將獲得的PCR產(chǎn)物按照瓊脂糖凝膠DNA 回收試劑盒說明書的操作步驟割膠純化，送深圳華大基因有限公司進(jìn)行雙向測序，測序引物同于擴(kuò)增引物。所得的測序結(jié)果經(jīng)拼接并刪除兩端引物序列，獲得最終的擴(kuò)增序列。

1.3.4 PCR產(chǎn)物克隆測序

克隆測序用于驗(yàn)證PCR產(chǎn)物測序結(jié)果的準(zhǔn)確性，尤其針對多成分肉制品的PCR產(chǎn)物采用挑選不同陽性克隆進(jìn)行測序分析。對PCR產(chǎn)物進(jìn)行純化，隨后按T-vector試劑盒推薦反應(yīng)體系與pGEM-T載體連接，導(dǎo)入DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，36℃培養(yǎng)過夜，經(jīng)過藍(lán)-白斑篩選后，挑取3～10個不同的白色單菌落進(jìn)行菌落PCR驗(yàn)證。陽性克隆菌落接種到LB液體培養(yǎng)基（含有100μg/mL氨芐青霉素）中，在36℃、180r/min搖床上培養(yǎng)過夜，吸取菌液1mL抽提質(zhì)粒DNA，并送深圳華大基因進(jìn)行測序。測序引物采用T7通用測序引物。

1.3.5 擴(kuò)增序列分析比對

PCR產(chǎn)物直接測序或克隆測序后，去除擴(kuò)增引物序列，提交GenBank進(jìn)行BLAST比對[12]，并使用BOLD網(wǎng)站[13]的數(shù)據(jù)庫對樣品的CO I序列進(jìn)行鑒定以及相似度分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 線粒體CO Ⅰ基因片段的擴(kuò)增

以動物基因組DNA提取試劑盒提取樣品基因組DNA后，應(yīng)用CO Ⅰ通用引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物以1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。結(jié)果表明，冷凍魚、魚丸、蝦餃、蝦醬等水產(chǎn)品的CO Ⅰ序列可以用通用引物擴(kuò)增出來，說明通用引物的通用性高，可用于魚肉中CO Ⅰ基因的擴(kuò)增。圖1顯示的是申報為龍利魚柳冷凍魚肉的CO Ⅰ、CO Ⅱ、ITS擴(kuò)增及一份魚丸樣品的CO I序列擴(kuò)增。

2.2 冷凍魚柳CO Ⅰ測序結(jié)果分析

對龍利魚柳冷凍魚肉樣品的PCR產(chǎn)物直接測序和克隆測序結(jié)果經(jīng)Chromas軟件驗(yàn)證，圖譜一致，且為有效序列。經(jīng)比對分析，從PCR全長序列中去除兩端引物的堿基，所得有效序列為658bp。

2.3 與GenBank中的序列比對

冷凍龍利魚柳的PCR產(chǎn)物所測定序列與GenBank中核酸序列進(jìn)行BLAST比對，結(jié)果與編號gb|JN021313.1公布的654bp的Pangasianodon hypophthalmus線粒體CO I序列相似性為99.8%，其中僅有1個堿基差異。詳細(xì)信息如圖2所示。

2.4 與BOLD數(shù)據(jù)庫中的序列比對分析

將PCR擴(kuò)增并測序得到的CO Ⅰ有效序列提交BOLD （Barcoding life）DNA條形碼數(shù)據(jù)庫分析，鑒定結(jié)果取相似度最高的前8位，見表1。

該冷凍魚肉樣品為口岸截獲，進(jìn)口商在入境申報時申報該冷凍魚肉樣品為龍利魚柳，被截獲后改稱巴沙魚。本實(shí)驗(yàn)室取樣進(jìn)行CO Ⅰ PCR擴(kuò)增，測序結(jié)果分別經(jīng)GenBank Blast比對及BOLD DNA條形碼數(shù)據(jù)庫分析，鑒定名稱為Pangasianodon hypophthalmus，學(xué)名蘇氏圓腹魚芒，屬魚芒鯰科（Pangasiidae），分類學(xué)上在屬一級小有爭議，中文名多稱為巴丁魚。目前國內(nèi)水產(chǎn)品市場多存在混淆名稱的“潛規(guī)則”現(xiàn)象。以本批次樣品為例，國內(nèi)賣家近年來通稱越南巴沙魚為龍利魚，而包括多家水產(chǎn)門戶網(wǎng)站也都將巴丁魚歸為巴沙魚家族的一員。其實(shí)3者是不同的魚種，巴丁魚和巴沙魚的區(qū)別非常小，主要是魚的口舌位、魚胸鰭條目數(shù)等略有差別，而龍利魚則親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，更為稀有和昂貴。

2.5 水產(chǎn)品檢測結(jié)果匯總及分析

本批次監(jiān)督抽檢共分析了16份進(jìn)出口企業(yè)抽檢及口岸截獲魚肉、魚丸、蝦餃等水產(chǎn)制品，經(jīng)DNA條形碼技術(shù)分析鑒定，除一份魚丸樣品未能鑒定出水產(chǎn)種類之外，其余15份樣品均成功擴(kuò)增CO Ⅰ基因片段，并通過GenBank和BOLD 數(shù)據(jù)庫比對分析鑒定出了水產(chǎn)種類，鑒定結(jié)果匯總見表2。

其中，未能成功PCR擴(kuò)增的8號白魚丸樣品經(jīng)嘗試CO Ⅱ、CO Ⅲ及ITS等多個候選標(biāo)靶基因均未能檢測到魚肉成分，ITS擴(kuò)增鑒定存在大豆基因成分，除證實(shí)該樣品基因組DNA提取成功外，也暗示了其本身存在不含魚肉成分的可能。從嚴(yán)格意義上講，16份樣品中僅有2份的鑒定結(jié)果與標(biāo)簽完全符合，占25.5%；約有31.25%的樣品鑒定結(jié)果與標(biāo)簽標(biāo)示不符。另有56.25%的樣品由于其標(biāo)簽本身未能標(biāo)示所含水產(chǎn)種類，而僅以魚或蝦的大類表示，根據(jù)檢測結(jié)果盡管不能判定其不合格，但也提示了產(chǎn)品標(biāo)簽制度有需要進(jìn)一步完善的地方。

需要說明的是，國際統(tǒng)一的生物物種命名應(yīng)用的是拉丁文名稱，DNA條形碼的鑒定結(jié)果給出的以拉丁文名為準(zhǔn)。而國內(nèi)常用的學(xué)名及俗名則常常是五花八門，這也在客觀上為一些不法商家摻假、造假提供了可乘之機(jī)。

3 討 論

動物性食源物種種類繁多，非專業(yè)人士很難鑒別，且消費(fèi)者在購買新鮮肉類、鮮活或冷凍水產(chǎn)品時，多是通過形態(tài)特征來判斷肉或魚的種類，但對于一些肉或魚肉制品（如肉餅、肉丸、魚片、魚丸等），則很難通過形態(tài)特征來判斷其原料的來源。食品行業(yè)一些不法商家正是利用此漏洞，為了追求最高商業(yè)利潤，便在加工食品中摻假造假，以低價食源冒充高價食品出售，一方面大大損害了消費(fèi)者的利益和健康，另一方面也造成了不正當(dāng)?shù)纳虡I(yè)競爭。其實(shí)，在此次“馬肉風(fēng)波”事件之前，國內(nèi)已經(jīng)爆出了應(yīng)用化學(xué)藥物處理的“假魚翅”、以牛肉膏處理的豬肉或鴨肉冒充牛肉等事件，但當(dāng)時輿論更多地導(dǎo)向了食品安全領(lǐng)域而非商業(yè)欺詐的造假本身。

DNA條形碼技術(shù)目前國際上比較公認(rèn)的是以細(xì)胞色素C氧化亞基Ⅰ（CO Ⅰ）的基因作為鑒定物種的靶基因，現(xiàn)有的研究數(shù)據(jù)表明絕大多數(shù)物種的CO Ⅰ序列表現(xiàn)出低的種內(nèi)遺傳差異及相對較高的種間差異[14-15]。該項(xiàng)技術(shù)能避免形態(tài)學(xué)分類的缺陷，對鑒定者的經(jīng)驗(yàn)和專業(yè)知識背景要求較低。相比較于特異PCR、熒光PCR等技術(shù)，DNA條形碼技術(shù)有著無可比擬的優(yōu)勢，但是DNA條形碼鑒別技術(shù)需要有專門的數(shù)據(jù)庫作為支撐。由于動物性食源種類繁多，目前的DNA條形碼數(shù)據(jù)庫還遠(yuǎn)遠(yuǎn)不夠完善，應(yīng)用國際共享的DNA條形碼數(shù)據(jù)庫進(jìn)行序列分析比對仍存在一定的不確定因素。同時，對于部分種類尤其是多成分加工食品的鑒別還需要在輔助靶基因[16]的篩選，與特異PCR、熒光PCR、AFLP及芯片技術(shù)相結(jié)合等方面進(jìn)一步探索。

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